Kabar

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Sel kanker wis ngembangake macem-macem mekanisme kanggo ngatasi stres sel lan terus maju.Protein kinase R (PKR) lan aktivator protein (PACT) minangka respon awal sing ngawasi macem-macem sinyal stres sing nyebabake inhibisi proliferasi sel lan apoptosis.Nanging, regulasi jalur PACT-PKR ing sel kanker tetep ora dingerteni.Ing kene, kita nemokake yen long non-coding RNA (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) langsung melu nyegah jalur PACT-PKR lan ningkatake proliferasi sel kanker.Nggunakake screening fungsional skala gedhe saka lncRNA sing ana gandhengane karo kanker CRISPRi 971, kita nemokake manawa DARS-AS1 digandhengake karo proliferasi sel kanker sing saya tambah akeh.Mulane, KO DARS-AS1 nyegah proliferasi sel lan ningkatake apoptosis sel kanker ing macem-macem garis sel kanker in vitro lan nyuda pertumbuhan tumor ing vivo kanthi signifikan.Secara mekanis, DARS-AS1 langsung nyambung menyang domain aktivasi PACT lan nyegah interaksi PACT-PKR, saéngga nyuda aktivasi PKR, fosforilasi eIF2α, lan nyegah kematian sel apoptosis.Secara klinis, DARS-AS1 sacara umum dituduhake ing pirang-pirang kanker, lan overexpression saka lncRNA iki nuduhake prognosis sing ora apik.Panliten iki njlentrehake regulasi khusus kanker saka jalur PACT-PKR dening DARS-AS1 lncRNA lan menehi target liyane kanggo prognosis lan perawatan kanker.
Kemampuan kanggo adaptasi karo stres minangka ciri penting kanggo urip lan proliferasi sel kanker.Proliferasi kanthi cepet lan ciri metabolis kanker puncak ing lingkungan mikro sing atos - kekurangan nutrisi, hipoksia, lan pH sing sithik - sing bisa nyebabake jalur tandha mati sel.Disregulasi gen sensitif stres kayata p535, protein kejut panas 6, 7, KRAS8, 9, lan HIF-110, 11, 12, 13 asring diamati ing kanker, saéngga ngalangi apoptosis lan ningkatake kaslametan.
Protein kinase R (PKR) minangka sensor stres sing penting lan subunit kinase saka faktor inisiasi eukariotik 2α (eIF2α), regulator translasi sing ngubungake stres seluler menyang pati sel.PKR wiwitane diidentifikasi minangka protein antivirus kanthi deteksi RNA untai ganda asing (dsRNA).Sawise aktivasi, PKR phosphorylates eIF2α kanggo nyandhet sintesis protein virus lan seluler14,15,16.PACT (protein aktivator PKR) wis diidentifikasi minangka protein aktivator PKR pisanan tanpa ana dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Liwat interaksi langsung karo PKR, PACT nransfer macem-macem tekanan (keluwen serum, peroksida utawa perawatan arsenit) menyang PKR lan jalur sinyal hilir.Saliyane fosforilasi eIF2α, aktivasi PKR sing dimediasi PACT nyebabake macem-macem acara sing ana gandhengane karo respon stres, kalebu status redoks sing diowahi liwat jalur PI3K / Akt24, mriksa karusakan DNA sing ditingkatake liwat p5325,26 lan NF-κB27,28 Ngatur transkripsi, 29. Amarga peran kritis ing respon stres, proliferasi, apoptosis lan proses seluler kunci liyane, PKR lan PACT njanjeni target terapi kanggo akeh penyakit, utamane kanker30,31,32,33.Nanging, senadyan pinunjul fungsional lan biologis pleiotropik iki, regulasi aktivitas PACT / PKR ing sel kanker tetep angel dipahami.
lncRNA minangka transkrip sing luwih gedhe tinimbang 200 nukleotida tanpa potensial pengkodean protein.Wiwit kabeh proyèk urutan génom sing mutakhir wis ngidentifikasi ewonan lncRNA, 35,36 akeh upaya wis ditindakake kanggo njlentrehake fungsi biologis.Panliten sing saya tambah akeh nuduhake manawa lncRNA melu akeh proses biologis37 kalebu regulasi inaktivasi kromosom X38,39, imprinting40, transkripsi41,42, terjemahan43 lan malah pertumbuhan kanker44,45,46,47.Panaliten kasebut nglaporake manawa akeh lncRNA sing melu ing jalur PACT/PKR.Siji panaliten kasebut nuduhake yen lncRNA ASPACT nyandhet transkripsi PACT lan nambah retensi nuklir saka mRNA PACT.Panaliten liyane nuduhake manawa lncRNA nc886 ngiket PKR lan nyegah fosforilasi49,50.Nganti saiki, lncRNA sing ngatur aktivasi PKR sing dimediasi PACT durung dilaporake.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) wis diidentifikasi minangka lncRNA51,52,53,54 onkogenik.Liwat regulasi miP-194-5p53, miP-12952 lan miP-532-3p51, DARS-AS1 wis ditampilake kanggo ningkatake pertumbuhan karsinoma sel ginjal sel sing cetha, karsinoma tiroid lan karsinoma paru-paru sel non-cilik.Tong lan kanca-kanca uga nemokake yen DARS-AS1 ningkatake perkembangan myeloma kanthi njaga stabilitas motif RNA-binding protein 39 (RBM39).Nanging, ora ana panaliten sing ditindakake apa lncRNA iki melu regulasi aktivasi PACT-PKR lan respon stres sel kanker.
Ing kene, kita nindakake layar mundhut-fungsi skala gedhe nggunakake sistem CRISPRi lan nemtokake manawa DARS-AS1 lncRNA ningkatake panyebaran sawetara jinis sel kanker.Kajaba iku, kita wis nemtokake mekanisme utama: DARS-AS1 langsung nyambung menyang PACT, nyegah pengikatan PACT lan PKR, nyegah fosforilasi eIF2α, substrat PKR sing luwih murah, lan pungkasane nyegah pati sel apoptosis.Kesimpulane, karya kita mbukak DARS-AS1 lncRNA minangka regulator jalur PACT-PKR lan target potensial kanggo perawatan lan prognosis kanker.
Pasinaon profil genomik ekstensif wis nemtokake atusan lncRNA sing ana gandhengane karo kanker.Nanging, fungsine tetep ora dingerteni56.Kanggo ngenali calon lncRNA janjeni melu ing kemajuan kanker, kita nindakake layar mundhut-of-fungsi kanggo suda proliferasi ing sel kanker kolorektal SW620 nggunakake sistem CRISPRi (Fig. 1a).Fitur unik saka garis sel kanker usus besar SW480 lan SW620 yaiku asale saka tumor primer lan sekunder ing siji pasien.Iki menehi perbandingan sing migunani kanggo nyinaoni owah-owahan genetik ing perkembangan kanker usus lanjut.Mula, kita nganalisa transkrip garis sel kanker kolorektal (SW480 lan SW620) nggunakake urutan RNA lan nglumpukake sawetara lncRNA fungsional potensial saka literatur sing diterbitake.Adhedhasar asil kasebut, kita ngrancang perpustakaan sgRNA sing ngemot 7355 sgRNA oligos sing nargetake 971 lncRNA sing gegandhengan karo kanker lan 500 oligos sgRNA sing ora ditargetake kanggo kontrol negatif (Data Tambahan 1).
Representasi skematis saka screening nggunakake sistem CRISPRi.pengayaan b sgRNA sawise screening.Garis burik horisontal nggambarake log2 (owahan lipatan) = ± 0,58.Garis titik vertikal nuduhake nilai p = 0,05.Titik ireng nggambarake sgRNA non-target (ditunjuk minangka NC).Titik abang minangka sgRNA sing ngarahake DARS-AS1.Titik biru yaiku sgRNA sing ngarahake LINC00205, lncRNA onkogenik sing wis diterangake sadurunge.owah-owahan lipatan = (waca normal, dina 17) / (waca normal, dina 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown nyandhet wutah sel.Bar kesalahan makili ± standar deviasi saka telung eksperimen.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 tes t Siswa rong buntut.d Ekspresi DARS-AS1 ing tumor (dataset TCGA).Ekspresi DARS-AS1 ing sampel normal lan tumor sing dipasangake saka pasien karo BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, lan COAD (dataset TCGA).Nilai-p dipikolehi kanthi nggunakake t-test Student two-tailed pasangan.
Sawise mbangun plasmid lan ngemas lentivirus, kita transduksi garis sel kanker kolorektal dCas9-SW620 kanthi perpustakaan ing ndhuwur ing papat eksperimen infeksi independen.Multiplicity of infection (MOI) kanggo infèksi iki ana 0.1-0.3, nuduhake yen saben sel mung bisa ditransfeksi nganggo siji sgRNA.Sawise 18 dina kultur in vitro, profil pengayaan target sgRNAs suda utawa tambah sawise screening, dene jumlah oligonukleotida kontrol sing ora ditargetake tetep ora owah dibandhingake karo profil pra-screening, nuduhake yen target kita duwe layar khusus banget. perpustakaan.Sego.1b lan tabel tambahan 1). LINC00205, sing sadurunge dilapurake kanggo ningkatake kanker paru-paru lan kanker ati progression58,59,60, disaring metu (log2 (foldchange) <-0,58, p nilai <0,05), konfirmasi linuwih saka screening iki (Fig. 1b). LINC00205, sing sadurunge dilapurake kanggo ningkatake kanker paru-paru lan kanker ati progression58,59,60, disaring metu (log2 (foldchange) <-0,58, p nilai <0,05), konfirmasi linuwih saka screening iki (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, sing sadurunge dilapurake kanggo ningkatake perkembangan kanker paru-paru lan kanker ati58,59,60, ora kalebu (log2 (pangowahan lipatan) <-0,58, p-value <0,05), ngonfirmasi kakuwatan screening iki (Gbr. 1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被被 选选 (log2 (倍数 倍数) <-0.58, p 值 <0.05), 证实证实 该 筛选 的 可靠性 (图 1B). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被被 选选 (log2 (倍数 倍数) <-0.58, p 值 <0.05), 证实证实 该 筛选 的 可靠性 (图 1B). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, sing sadurunge dilapurake kanggo ningkatake perkembangan kanker paru-paru lan ati58,59,60, ora kalebu (log2 (pangowahan lipatan) <-0,58, p-value <0,05), ngonfirmasi kekuwatan screening iki (Fig. 1b).
Ing antarane kabeh lncRNA sing dites, DARS-AS1 uga disaring, kanthi telung oligonukleotida sgRNA cognate suda sacara signifikan sawise 18 dina budaya, nuduhake yen knockdown saka lncRNA iki nyebabake proliferasi kanker suda (Gambar 1b).Asil iki luwih didhukung dening analisis MTS ing sel kanker kolorektal sing nuduhake yen tingkat pertumbuhan sel knockdown DARS-AS1 mung dipérang dadi setengah dibandhingake karo sel kontrol (Gambar 1c) lan konsisten karo laporan sadurunge sawetara jinis kanker liyane.: kanker ginjal sel bening, kanker tiroid lan kanker paru-paru non-sel cilik51,52,53,55.Nanging, fungsi lan mekanisme molekuler ing kanker kolorektal tetep durung diteliti.Mula, kita milih lncRNA iki kanggo sinau luwih lanjut.
Kanggo nyinaoni ekspresi DARS-AS1 ing pasien, kita nganalisa kanthi lengkap 10,327 sampel tumor saka proyek Cancer Genome Atlas (TCGA).Asil kita nuduhake yen DARS-AS1 sacara wiyar lan diregulasi sacara signifikan ing sel sehat ing macem-macem tumor, kalebu adenokarsinoma usus besar (COAD), karsinoma sel bening ginjel (KIRC), lan karsinoma sel papillary ginjel (KIRP)..Sithik banget (Gambar 1d lan Gambar Tambahan 1a, b). Analisis sampel sehat / tumor sing dipasangake luwih dikonfirmasi ekspresi DARS-AS1 sing luwih dhuwur ing tumor karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel bening ginjal (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), karsinoma sel skuamosa paru (LUSC) , karsinoma endometrium korpus uterus (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler hati (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal ginjal (KIRP), lan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p <0,05) (Gambar 1e–m) . Analisis sampel sehat / tumor sing dipasangake luwih dikonfirmasi ekspresi DARS-AS1 sing luwih dhuwur ing tumor karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel bening ginjal (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), karsinoma sel skuamosa paru (LUSC) , karsinoma endometrium korpus uterus (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler hati (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal ginjal (KIRP), lan adenokarsinoma kolon (COAD) (nilai p <0,05) (Gambar 1e–m) .Analisis sampel sehat / tumor sing dipasangake uga dikonfirmasi ekspresi DARS-AS1 sing luwih dhuwur ing karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel ginjal lan sel ginjal (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), tumor karsinoma sel skuamosa paru (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , karsinoma endometrium korpus uteri (UCEC), adenokarsinoma paru-paru (LUAD), karsinoma hepatoseluler hati (LIHC), karsinoma sel papiler ginjal (KIRP), dan adenokarsinoma usus besar (COAD) (nilai p < 0.05) (Gambar 1e– m).配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 了 DARS-AS1 在 尿路 尿路 上尿路 (BLCA), 肾肾 透明透明 (KIRC), 前列前列 (prad), 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高高, 子宫体子宫子宫体子宫 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝肝肝 (lihc), 肾肾 乳头状乳头状 (kirp) 和结肠腺癌 (KIRP) <0,05）（1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 证实 的 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌皮癌, 肾肾 细胞癌皮癌 细胞癌 皮癌 皮癌, 肾肾 细胞癌细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列前列腺腺癌 (prad), 细胞癌细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 的 的中 中 中 高 表达 中 中 高 表达 中 高 表达 表达 高 高 高 高 高 高 高 高 高癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analisis sampel pasangan sehat / tumor luwih ndhukung peran DARS-AS1 ing karsinoma urothelial kandung kemih (BLCA), karsinoma sel ginjal sel bening (KIRC), adenokarsinoma prostat (PRAD), lan tumor karsinoma sel skuamosa paru (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ekspresi ing corpus uterine carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), and colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0,05) (Gambar 1e -m).Digabungake, asil kasebut nuduhake yen DARS-AS1 akeh banget lan dituduhake ing macem-macem kanker.
Amarga DARS-AS1 lan DARS (gen sing ngodhe untaian antisense) nuduhake promotor sing padha lan dumunung ing jejere siji liyane, kita ngrancang shRNA kanthi khusus kanggo ngalahake DARS-AS1 nanging ora DARS (Tambahan Gambar 2a, b lan Tabel Tambahan 2) .Saliyane SW620, kita uga nggunakake telung garis sel liyane sing nyatakake DARS-AS1 kanggo nyinaoni khasiat lan fungsi knockdown shRNA (Tabel Tambahan 3).Asil kita nuduhake yen kabeh telung shRNA sing dikembangake entuk paling sethithik 80% efisiensi knockdown DARS-AS1 kanthi efek cilik ing jumlah mRNA DARS (Tambahan Gambar 2c-f).Kajaba iku, kita nemokake yen knockdown DARS-AS1 karo shRNA kasebut sacara signifikan nyandhet pertumbuhan sel ing garis sel kanker kolorektal SW620 (49.7%) lan HCT116 (27.7%), garis sel kanker payudara MBA-MD-231 (53.4%).) lan garis sel hepatoma HepG2 (pengurangan 92,7%), uga kemampuane kanggo mbentuk bola sing ora sauh (pengurangan rata-rata ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% lan 75,7% saben baris sel) (Gambar 2a, b).Ing SW620, asil tes formasi koloni luwih dikonfirmasi manawa DARS-AS1 shRNA sacara signifikan nyegah proliferasi sel kanthi rata-rata nyuda kira-kira 69,6% (Gambar 2c).
Efek kontrol shRNA lan DARS-AS1 shRNA ing proliferasi sel (a) lan pembentukan spheroid (b) ing sel SW620, HCT116, MBA-MD-231, lan HepG2.c Pengaruh kontrol shRNA lan DARS-AS1 shRNA ing pembentukan koloni ing sel SW620.Proliferasi sel (d), pembentukan spheroid (e), lan pembentukan koloni (f) sel SW620 sing overexpressing DARS-AS1.Data sing dituduhake yaiku rata-rata ± standar deviasi saka telung eksperimen.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, lan *** p ≤ 0,001 kanthi t-test Siswa loro-buntut.
Kanggo nglengkapi studi mundhut-fungsi, kita banjur nggawe sel SW620 overexpressing DARS-AS1 (Tambahan Gambar. 2g).Overexpression DARS-AS1 sacara signifikan ningkatake pertumbuhan sel (1,8 kali lipat), pembentukan spheroid sing ora disambungake (1,4 kali lipat), lan pembentukan koloni (3,3 kali lipat) ing sel SW620 (Gambar 2d-f).Kita dikonfirmasi asil iki nggunakake liyane DARS-AS1 garis sel, A549.Proliferasi sel sing ditingkatake amarga overexpression DARS-AS1 luwih diamati ing sel A549 (Tambahan Gambar 2h, i lan Tabel Tambahan 3).Digabungake, panaliten gain lan rugi iki nuduhake yen DARS-AS1 ningkatake proliferasi sel kanker ing vitro.
Kanggo njelajah mekanisme dhasar ing ngendi DARS-AS1 ngatur proliferasi sel, kita nindakake analisis pull-mudhun RNA kanggo ngenali mitra pengikat protein potensial.Hasil RT-qPCR nuduhake yen babagan 86,2% DARS-AS1 dumunung ing sitoplasma sel SW620 (Tambahan Gambar 3a).DARS-AS1 utawa pseudoRNA sing ditranskripsi in vitro banjur diinkubasi karo lisat sel SW620 diikuti pemisahan SDS-PAGE.Pewarnaan perak sakteruse nuduhake yen pita sing béda (~ 38 kDa) diperkaya sacara signifikan ing sampel tarik DARS-AS1 nanging ora ana ing sampel RNA utawa manik-manik (Fig. 3a).Pita iki diidentifikasi minangka protein aktivasi PKR (PACT) kanthi spektrometri massa (MS) lan luwih dikonfirmasi kanthi immunoblotting ing garis sel SW620, HCT116, lan HepG2 (Fig. 3a, b).Pengayaan DARS lan protein PACT sing gegandhengan - PKR lan TRBP - uga diselidiki nggunakake analisis RNA dening Western blotting (WB).Asil kasebut nuduhake yen ora ana interaksi langsung antarane DARS-AS1 RNA lan telung protein kasebut ditemokake (Tambahan Gambar 3b).Interaksi spesifik antarane DARS-AS1 lan PACT luwih dikonfirmasi dening analisis RNA immunoprecipitation (RIP), sing nuduhake yen DARS-AS1 sacara signifikan diperkaya ing antibodi anti-PACT nanging ora RNA kontrol liyane (Gambar 3c).Kanggo nemtokake manawa DARS-AS1 sesambungan langsung karo PACT tanpa ana komponen seluler liyane, tes in vitro biolayer interferometry (BLI) ditindakake nggunakake PACT sing diresiki.Biotin-label DARS-AS1 utawa dummy RNA diimobilisasi ing biosensor streptavidin (SA) banjur diinkubasi ing buffer kinetik sing ngemot 1 μM PACT.Utamane, PACT kaiket banget karo DARS-AS1 (nilai KD ~ 26.9 nM), nanging ora niru RNA (Gambar 3d).Digabungake, asil kasebut nuduhake interaksi langsung lan afinitas dhuwur antarane DARS-AS1 lan PACT.
Analisis tarikan RNA ngenali DARS-AS1 sing sesambungan karo PACT ing sel SW620.Ndhuwur, pewarnaan perak saka protein sing gegandhengan.Imunoblot ngisor ditindakake kanthi antibodi anti-PACT.b Analisis pull-mudhun RNA ditindakake ing sel HCT116 (ndhuwur) lan HepG2 (ngisor).Pengayaan PACT dideteksi kanthi immunoblotting.cRNA immunoprecipitation (RIP) assays ditindakake ing sel SW620 nggunakake antibodi sing dituduhake.Kurva pengikatan PACT menyang DARS-AS1 utawa RNA kontrol lengkap dipikolehi nggunakake interferometri biolayer (BLI).RNA diimobilisasi ing biosensor streptavidin.1 μM PACT digunakake kanggo ngukur asosiasi.e RNA pull assay dileksanakake nggunakake biotinilated full-dawa DARS-AS1 utawa truncated (ndhuwur).Immunoblot nuduhake PACT ditampa (ngisor).f PACT sing ditandhani sing diresiki diinkubasi karo DARS-AS1 lengkap biotinilasi utawa dipotong (kaya ing e) kanggo uji RIP in vitro.RNA sing diekstrak diverifikasi dening RT-qPCR.g Afinitas relatif saka fragmen RNA sing beda kanggo PACT dijupuk nggunakake interferometri biolayer.Kanggo analisis, 100 nM RNA lan 1 μM RAST digunakake.h In vitro RIP assays dileksanakake nggunakake dimurnèkaké utuh utawa truncated labeled PACT.RNA sing diekstrak diverifikasi dening RT-qPCR.i Tingkat wutah sel SW620 overexpressing DARS-AS1, PACT, utawa loro-lorone.j Overexpression saka lengkap utawa truncated DARS-AS1 ing sel SW620 duwe efek beda ing wutah sel.k Apoptosis dideteksi kanthi immunoblotting karo antibodi anti-PARP.l Knockout DARS-AS1 nyebabake apoptosis sel SW620 kaya sing dituduhake dening cytometry aliran.Data sing dituduhake yaiku rata-rata ± standar deviasi saka telung eksperimen. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, kanthi uji t Siswa rong buntut. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001, kanthi uji t Siswa rong buntut. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kanthi uji t Siswa rong buntut. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kanthi uji t Siswa rong buntut.
Kita banjur ngasilake telung fragmen RNA DARS-AS1 biotinilasi kanthi transkripsi in vitro kanggo ngenali wilayah DARS-AS1 sing dibutuhake kanggo asosiasi PACT (Gambar 3e).Asil analisis RNA nuduhake yen saben fragmen bisa sesambungan karo PACT, nanging wilayah 3′-terminal (384-768 nukleotida label A3) nuduhake luwih saka 1-384 nukleotida label A1) (Fig. 3e).Asil sing padha diamati ing tes RIP in vitro nggunakake PACT rekombinan (Gambar 3f).Selaras karo asil kasebut, eksperimen kanggo ngiket fragmen RNA sing ora bisa digerakake menyang PACT nggunakake BLI uga nuduhake yen PACT nduweni afinitas sing luwih dhuwur kanggo A3 (384-768 nt) (nilai KD kira-kira 94.6 nM), nalika meh ora ana hubungane karo wilayah liyane.(Gambar 3d).
Kita uga nliti wilayah sing ana gandhengane ing PACT.PACT ngemot telung domain fungsional, loro ing antarane yaiku domain RNA-binding double-stranded (dsRBD) lan domain katelu (ditunjuk D3) sing tumindak minangka aktivator interaksi protein.Kanggo nliti kapasitas naleni lncRNA saben domain, kita ngrancang telung mutasi sing ngilangi saben telung domain kasebut lan nindakake tes RIP in vitro.Asil kita nuduhake yen pambusakan domain katelu (D3) saka PACT kanthi signifikan nyuda interaksi karo DARS-AS1 (dening 0,11 kali lipat dibandhingake karo PACT sing utuh) dibandhingake karo rong mutasi liyane (Fig. 3h), dituduhake yen release saka D3 sesambungan karo DARS.-AC1.Digabungake, asil kasebut nuduhake yen interaksi antarane DARS-AS1 lan PACT bisa kedadeyan utamane liwat mburi 3' DARS-AS1 lan domain D3 PACT.
Kita nyathet yen DARS-AS1 ora duwe pengaruh marang ekspresi PACT lan PACT ora duwe pengaruh marang DARS-AS1 (Tambahan Gambar 3c).Kita banjur mriksa efek knockdown PACT ing pertumbuhan sel.Beda karo DARS-AS1, sel relatif mundhak 1.5-3 kaping luwih cepet nalika PACT dibuwang (Tambahan Gambar 3d).Asil tes pembentukan koloni nuduhake yen sel kasebut mbentuk koloni 2-3 kali lipat sawise perawatan shRNA karo PACT (Tambahan Gambar 3e).Kanggo nguji apa DARS-AS1 ngatur proliferasi sel liwat PACT, kita ngasilake sel SW620 sing overexpressing PACT, DARS-AS1, utawa loro-lorone.Overexpression saka PACT nuduhake inhibisi sing signifikan saka proliferasi sel (Gambar 3i).Nalika overexpression DARS-AS1 per se sacara signifikan ningkatake proliferasi sel, ora ana bedane sing signifikan ing tingkat pertumbuhan sel sing overexpressing DARS-AS1 lan PACT.Asil kasebut nuduhake manawa PACT bisa nglawan proliferasi tambah sing disebabake overexpression DARS-AS1.
Amarga wilayah DARS-AS1 sing beda-beda duwe kabisan ngiket PACT sing beda, kita nyelidiki pengaruhe relatif marang proliferasi sel kanthi overexpression fragmen DARS-AS1 sing beda.Dibandhingake karo rong fragmen liyane, DARS-AS1 overexpressed ing mburi 3' (384-768 nt), wilayah sing gegandhengan karo PACT utama ing DARS-AS1, sing nduweni kemampuan paling dhuwur kanggo ngrangsang proliferasi sel (Gambar 3j).Asil kasebut nuduhake korélasi positif antarane kapasitas ikatan lan fungsi biologis DARS-AS1.
PACT wis dilaporake minangka protein pro-apoptosis19.Mulane, kita nyelidiki efek DARS-AS1 ing apoptosis.Kaya sing dikarepake, knockdown DARS-AS1 kanthi signifikan ningkatake pembelahan PARP ing sel SW620 lan nambah proporsi sel positif annexin V ing garis sel SW620, HCT116, HepG2, lan MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f-h), nuduhake yen efek anti-apoptosis DARS-AS1 ing sel kanker ngelawan karo fungsi apoptosis-inducing PACT.Digabungake, asil kasebut nuduhake yen mekanisme fungsi onkogenik DARS-AS1 bisa uga liwat inhibisi fungsi PACT.
Sabanjure, kita njelajah implikasi fungsional saka asosiasi DARS-AS1-PACT.PACT wis dilaporake ngaktifake PKR liwat interaksi langsung, sing banjur nambah fosforilasi eIF2α, nyebabake penghapusan translasi lan apoptosis17.Kaping pisanan, kita mriksa apa DARS-AS1 mengaruhi lokalisasi seluler PACT lan PKR.Mikroskopi fluoresensi confocal nuduhake yen PACT lan PKR banget kolokalisasi ing sel SW620 kanthi koefisien korelasi Pearson rata-rata 0,72.Kangge, overexpression DARS-AS1 sacara signifikan nyuda PACT lan PKR co-lokalisasi (tegese koefisien korelasi Pearson 0.61) (Gambar 4a).Kanggo neliti apa DARS-AS1 bisa ngowahi interaksi PACT-PKR, kita nindakake uji co-immunoprecipitation (co-IP) kanthi antibodi anti-PACT ing lisat sel SW620.PKR iki Highly enriched ing anti-PACT ing sel kontrol, nalika Recovery PKR wis suda Ngartekno ing lysates saka sel overexpressing DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT lan PKR kanthi label sing diresiki digunakake kanggo tes ikatan protein in vitro.Mulane, sing nyedhiyakake DARS-AS1 nanging ora ana kontrol RNA nuduhake interaksi PACT-PKR sing ditindhes (Gambar 4c).Kabeh asil nuduhake yen DARS-AS1 ngganggu komunikasi PACT lan PKR.
a Co-lokalisasi PACT lan PKR ing sel kontrol utawa sel overexpressing DARS-AS1 diamati nggunakake mikroskop fluoresensi confocal.Inti kasebut diwarnai karo DAPI.Asil statistik dipikolehi saka 16 foto.b Co-immunoprecipitation (co-IP) nggunakake antibodi anti-PACT ing lysates sel kontrol sel SW620 utawa sel overexpressing DARS-AS1.c Labeled PACT, PKR dimurnèkaké lan ditranskripsi in vitro karo DARS-AS1 utawa mock RNA diinkubasi kanggo analisis ikatan protein in vitro.Antibodi anti-flag digunakake kanggo immunoprecipitation.d Imunoblots kanthi antibodi sing dituduhake ditindakake ing sel SW620 lan HCT116 sing ditransfeksi kanthi kontrol shRNA utawa DARS-AS1-shRNA sing diikuti dening keluwen serum.Tingkat ekspresi DARS-AS1 ngowahi sensitivitas seluler kanggo thapsigargin.Sel SW620 ditransfeksi karo DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid utawa kontrol plasmid.Sel diobati karo thapsigargin sajrone 48 jam lan daya tahan sel ditemtokake nggunakake reagen MTS.f In vitro transkripsi DARS-AS1 utawa dummy RNA lan PACT diresiki digunakake kanggo in vitro activation assay lan deteksi immunoblot.g Immunoblots nggunakake antibodi iki dileksanakake ing sel SW620-ctrl (kiwa) utawa sel overexpressing PKR mutan (tengen).Sel-sel kasebut banjur ditransfeksi nganggo shRNA kontrol utawa DARS-AS1-shRNA banjur keluwen serum.h Aliran cytometry nuduhake yen inaktivasi PKR mutant menehi ganti rugi kanggo apoptosis sing diakibatake DARS-AS1 ing sel SW620.i Immunoblots karo antibodi sing dituduhake ditindakake ing sel SW620 (kiwa) utawa HCT116 (tengen).Sel sing ditransfeksi nganggo kontrol shRNA utawa DARS-AS1 shRNA ora ana serum lan ditambah karo 100 nM PKR C16 inhibitor utawa DMSO.Skala bar = 5 µm.Data sing dituduhake yaiku rata-rata ± standar deviasi saka telung eksperimen.* p ≤ 0,05 tes t Siswa rong buntut.
Umume dipercaya yen PACT sesambungan karo PKR17, fosforilasi PKR ing Thr451 bisa diinduksi.Asil kita nuduhake yen tingkat fosforilasi PKR mundhak kanthi signifikan ing sel knockdown DARS-AS1 sawise keluwen serum (Gambar 4d lan Gambar Tambahan 4a).Mulane, kita nemokake yen fosforilasi eIF2α, substrat PKR utama, uga tambah akeh dening DARS-AS1 shRNA (Gambar 4d lan Gambar Tambahan 4a).Thapsigargin minangka stresor ER sing nyebabake ER ngeculake Ca2 +.Perawatan karo thapsigargin wis dilapurake kanggo ngindhuksi ekspresi lan aktivasi PACT, sing luwih sesambungan karo lan ngaktifake PKR, anjog menyang apoptosis kanthi nambah fosforilasi eIF2α 18,61.Ing kene, kita nggunakake thapsigargin minangka stimulator jalur PACT / PKR kanggo neliti apa DARS-AS1 bisa mbantu sel ngatasi stres kanthi nyegah jalur PACT / PKR.Kita mirsani yen tingkat ekspresi DARS-AS1 hubungane positif karo resistensi sel kanggo thapsigargin.sel SW620 overexpressing DARS-AS1 slamet luwih apik nalika dianggep karo thapsigargin, nalika sel karo knockdown DARS-AS1 dadi luwih rentan (Fig. 4e).Konsisten karo asil kasebut, overexpression DARS-AS1 nyuda fosforilasi PKR sing disebabake dening thapsigargin (Tambahan Gambar 4b).Beda, sawise perawatan thapsigargin, PKR lan eIF2α difosforilasi kanthi luwih dhuwur ing sel knockdown DARS-AS1 dibandhingake karo sel kontrol (Tambahan Gambar 4b).Apike, thapsigargin nyebabake ekspresi DARS-AS1 kanthi cara gumantung dosis, sing bisa nuduhake fungsi anti-stres DARS-AS1 (Tambahan Gambar 4c).Kajaba iku, kita nindakake tes aktivasi in vitro kanggo konfirmasi pengamatan kasebut.Sedhela, PKR diresiki saka lisat sel nggunakake antibodi anti-PKR, banjur diinkubasi karo PACT rekombinan lan DARS-AS1 sing ditranskripsi in vitro.Sawise reaksi enzimatik, fosfo-PKR dideteksi nggunakake WB.Asil kita nuduhake yen fosforilasi PKR dicegah sacara signifikan dening DARS-AS1, nanging ora kanthi kontrol RNA (Gambar 4f).Hasil in vitro lan in vivo iki nuduhake yen DARS-AS1 nyegah aktivasi PKR sing dimediasi PACT.Ing wektu sing padha, kita uga mirsani nyuda pemulihan PACT ing ngarsane DARS-AS1 (Gambar 4f).Asil iki konsisten karo asil saka assay protein naleni in vitro (Figure 4c) lan maneh nggambarake fungsi pamblokiran DARS-AS1 kanggo asosiasi PACT-PKR.
Ser246 lan Ser287 ing domain D3 PACT dibutuhake kanggo aktivasi PKR ing stres seluler.Substitusi saka rong residu serine kanggo alanine menehi PACT mutant (mutD), sing ngaktifake PKR tanpa stres, lan substitusi alanin (mutA) ngowahi protokol kasebut.Amarga kita wis nuduhake pentinge domain iki kanthi asosiasi langsung karo DARS-AS1, kita nggawe rong mutan PACT iki kanggo nyoba apa residu kasebut uga bisa melu interaksi karo DARS-AS1.Apike, loro mutan ilang kemampuan kanggo ngiket DARS-AS1 (Tambahan Gambar 4d), sing nuduhake yen struktur lengkap protein PACT bisa uga dibutuhake kanggo interaksi efisien karo DARS-AS1.
Salajengipun, asil kita uga nuduhake yen inhibisi proliferasi sel sing disebabake DARS-AS1-shRNA bisa dibalekake sebagian kanthi overexpressing mutan PACT negatif dominan (PACTmutA) utawa mutant PKR negatif dominan (PKRmut) (Tambahan Gambar 4e. e).Overexpression saka mutan PKR sing dominan-negatif nyuda fosforilasi PKR sing diakibatake dening knockdown DARS-AS1 uga fosforilasi eIF2α ing sel sing ora duwe serum (Gambar 4g).Luwih penting, proporsi sel apoptosis sing disebabake dening knockdown DARS-AS1 uga dikurangi ing sel sing overexpressing PKRmut (Gambar 4h lan Gambar Tambahan 4g).Inhibisi aktivitas kinase PKR uga ngrusak fungsi DARS-AS1, amarga asil nuduhake yen knockdown DARS-AS1 arang micu fosforilasi PKR lan eIF2α nalika sel diobati karo inhibitor C16 khusus PKR (Gambar 4i lan Gambar Tambahan 4h).).Digabungake, asil kita nuduhake yen DARS-AS1 ningkatake proliferasi sel, paling ora sebagian, kanthi nyegah aktivasi PKR sing dimediasi PACT.
Kanggo luwih njelajah peran DARS-AS1 ing tumorigenesis, kita nindakake eksperimen vivo nggunakake model xenograft mouse. Asil nuduhake yen knockdown DARS-AS1 sacara dramatis nyuda pertumbuhan tumor ing tikus (nilai p <0.0001) (Gambar 5a). Asil nuduhake yen knockdown DARS-AS1 sacara dramatis nyuda pertumbuhan tumor ing tikus (nilai p <0.0001) (Gambar 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (mis. 5а). Asil nuduhake yen knockdown DARS-AS1 kanthi drastis nyuda pertumbuhan tumor ing tikus (nilai p <0.0001) (Gambar 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (umpamane 5а). Asil nuduhake yen knockdown DARS-AS1 sacara signifikan nyuda pertumbuhan tumor ing tikus (nilai p <0.0001) (Gambar 5a).Mangkono, ing klompok knockdown DARS-AS1, ana penurunan sing signifikan ing volume tumor rata-rata udakara 72.9% lan massa tumor rata-rata udakara 87.8% (Gambar 5b-d).Asil kasebut nuduhake manawa DARS-AS1 bisa ningkatake pertumbuhan tumor ing vivo.
Efek saka iklan DARS-AS1 knockdown ing onkogenesis kolorektal ing tikus mudo.Kurva pertumbuhan (a), ukuran tumor (b), bobot (c), lan gambar tumor (d) ditampilake.Bar kesalahan makili ± SEM. n = 10. ****p <0,0001, kanthi uji t Siswa loro-buntut. n = 10. ****p <0,0001, kanthi uji t Siswa loro-buntut. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 uji t Siswa rong buntut.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 tes t Siswa rong buntut.e Kaplan-Meier nganalisa korélasi antara tingkat ekspresi DARS-AS1 lan kaslametan sakabèhé ing pasien karo UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, lan LGG.Tingkat ekspresi DARS-AS1 sing dhuwur ing pasien ana ing ndhuwur 50%;tingkat kurang ekspresi DARS-AS1 ing pasien ana ing ngisor 50%.nilai-p ditemtokake nggunakake tes peringkat log.f Model sing diusulake ing ngendi DARS-AS1 ngatur jalur PACT-PKR lan pertumbuhan tumor.
Kanggo luwih ngerti pengaruh klinis DARS-AS1, kita nliti korélasi antarane ekspresi lan kaslametan pasien.Kanthi nganalisa dataset TCGA, kita nemokake yen ekspresi DARS-AS1 sing luwih dhuwur digandhengake karo melanoma uveal (UVM), kromofobia ginjal (KICH), karsinoma sel papillary ginjal (KIRP), mesothelioma (MESO), multipleks.Kelangsungan hidup sing luwih murah digandhengake karo morfosis glioblastoma (GBM) lan pasien kanthi glioma otak (LGG) tingkat rendah (Gambar 5e).Asil kasebut nuduhake yen DARS-AS1 bisa uga nduweni peran penting ing perkembangan tumor klinis lan bisa dadi biomarker prediktif potensial ing pirang-pirang kanker.
Ing panliten iki, nggunakake screening fungsional CRISPRi skala gedhe, kita nemtokake manawa DARS-AS1 lncRNA ngatasi stres sel kanker kanthi ngatur rong responden stres utama, PACT lan PKR.Kanthi sesambungan langsung karo PACT, DARS-AS1 nyegah aktivasi PKR sing dimediasi PACT, saéngga nyegah kematian sel apoptosis lan ningkatake proliferasi sel (Gambar 5f).Upregulasi DARS-AS1 wis diamati ing macem-macem jinis kanker, nuduhake manawa fungsine kanggo ningkatake kaslametan sel kanker ing kahanan stres bisa uga ditrapake kanggo macem-macem jinis kanker.
PACT wis diidentifikasi minangka protein aktivator PKR, lan aktivasi PKR sing dimediasi PACT nduweni peran penting ing respon stres kanthi ngatur transkripsi, terjemahan, apoptosis, lan proses seluler penting liyane62.Wis pirang-pirang dekade, upaya wis ditindakake kanggo ngerti aturan khusus kanker saka kaskade PACT-PKR.Ing kene, panlitene nuduhake mekanisme regulasi PACT-PKR sing beda ing sel kanker liwat lncRNA DARS-AS1 seluler, sing langsung ngiket PACT, ngalangi interaksi PACT-PKR, nyegah aktivasi PKR lan fosforilasi eIF2α, saéngga nyegah apoptosis sing diakibatake stres lan ngrangsang proliferasi kanker pungkasane.sel.Panemuan iki nerangake target lncRNA potensial kanggo prognosis lan terapi kanker.
Data kita nuduhake yen knockdown DARS-AS1 sensitizes sel kanggo keluwen serum karo Tambah pinunjul ing phosphorylated PKR lan eIF2α.Asil kasebut nuduhake yen DARS-AS1 ningkatake kaslametan sel kanker ing kahanan sing angel kanthi nyegah kegiatan PACT / PKR.Sawetara RNA non-coding liyane, kayata ASPACT lan nc886, uga melu ing sumbu PACT/PKR kanthi downregulating mRNA PACT48 utawa ngatur autofosforilasi kanthi ngiket PKR49,50,64.Antarane, DARS-AS1 tumindak minangka disruptor saka PACT-PKR paguyuban.Panaliten iki nambah pangerten babagan regulasi sumbu PACT / PKR lan peran lncRNA ing respon stres.
PACT ngandhut telung domain kapisah.Saben rong dsRBD pisanan cukup kanggo entuk ikatan afinitas dhuwur saka PACT menyang PKR, dene domain katelu (D3) dibutuhake kanggo aktivasi PKR in vitro lan in vivo.Panaliten kita nuduhake yen DARS-AS1 luwih seneng sesambungan karo domain D3 (Gambar 3h).Amarga ukuran lncRNA sing gedhe (768 nukleotida), DARS-AS1 sing ikatan karo D3 bisa nyegah interaksi fisik antarane domain PACT dsRBD lan PKR, saéngga ngalangi asosiasi PACT lan PKR.Mutasi titik PACT sing ngganti Ser246 lan Ser287 ing D3 karo alanin utawa aspartat ngganggu afinitas ikatan kanggo DARS-AS1, nuduhake pentinge sifat struktural lan listrik sakabèhé D3 ing asosiasi.Rincian liyane babagan mekanisme iki bakal dibutuhake ing mangsa ngarep, nggunakake analisis biokimia sing luwih tepat lan analisis struktur PACT resolusi dhuwur.
Panaliten sadurunge wis nglaporake yen DARS-AS1 ningkatake proliferasi sel liwat sawetara mekanisme51,52,53.Ing salah sawijining conto, penyidik ​​​​ngamati yen DARS-AS1 ngunggahake gen DARS-encoding protein antisense kanthi nargetake miP-194-5p ing sel kanker ginjel.Nanging, ing panliten iki, knockdown DARS-AS1 ora duwe pengaruh cilik marang transkripsi DARS ing pirang-pirang jinis kanker, kalebu paling ora kanker kolorektal, payudara, lan ati.Amarga lncRNAs nuduhake pola ekspresi spesifik sel lan jaringan, mekanisme fungsional bisa uga ora dilestarekake ing antarane jinis kanker, sing bisa nyebabake bedo iki antarane pengamatan lan penilaian sadurunge babagan kanker sing beda.Pasinaon khusus dibutuhake kanggo njlentrehake mekanisme spesifik saka macem-macem proses fisiologis lan patologis.
Analisis data klinis nuduhake yen ekspresi DARS-AS1 ing tumor ana hubungane karo kaslametan pasien kanker, sing negesake pentinge sumbu DARS-AS1 / PACT / PKR ing prognosis kanker.Kesimpulane, panliten kita nuduhake yen DARS-AS1 minangka regulator saka sumbu sinyal PACT / PKR, ningkatake proliferasi sel kanker, lan nyegah apoptosis sajrone respon stres, sing nyedhiyakake riset liyane lan menarik kanggo riset ing mangsa ngarep babagan perawatan potensial. .
Garis sel manungsa SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 lan HEK293T dijupuk saka Infrastruktur Sumber Daya Sel Nasional ing China.Kabeh sel disimpen ing medium DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ditambah karo 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) lan 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ing 37 ° C, 5% CO2.inkubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);mouse normal IgG, CST (5415S);IgG terwelu normal, CST (2729S).Antibodi diencerke 1:1000 ing PBST kanggo Western blotting lan 1:100 kanggo IP.
sgRNA dikembangake nggunakake alat sing kasedhiya kanggo umum sing diarani CRISPR-ERA66.Kita nggunakake paramèter alat standar kanggo pangembangan sgRNA lan algoritma ngetung situs ikatan sgRNA ing wilayah 3 kb.pusate ing TSS.Kolam renang oligonukleotida sgRNA disintesis ing CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) lan dikloning dadi plasmid pgRNA manungsa (Addgene #44248).Gunggunge 12 µg plasmid pgRNA manungsa sing dikumpulake, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), lan 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) ditransfeksi dadi 5 x 106 HEK293T dishes nggunakake Reaksi DNA 10 sel (CWBIO, Beijing, China) miturut pandhuan pabrikan.Supernatan sing ngemot virus diklumpukake 48 lan 72 jam sawise transfeksi lan disaring liwat saringan 0,45 µm.Kanggo screening, sel SW620 sing nyatakake protein fusi dCas9 / KRAB dijupuk kanthi transduksi virus.Sèl SW620 sing diowahi kena infèksi karo perpustakaan virus ing papat eksperimen infèksi independen ing MOI 0.1-0.3 lan sampel karo 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) kanggo 2 dina.Salajengipun, sel dibudidayakan 18 dina in vitro kanthi jangkoan perpustakaan minimal 500 sel/sgRNA kanggo screening.
DNA genom diekstraksi miturut instruksi Kit Midi Darah DNA QIAamp (QIAGEN, Düsseldorf, Jerman; 51183).Secara total, 100 μg DNA genom saben ulangan biologi digunakake kanggo mbangun perpustakaan.Wilayah sgRNA digedhekake dening rong putaran PCR lan disambungake menyang barcode.
Produk PCR diresiki nggunakake gel NucleoSpin® lan kit pemurnian PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Jerman; 740609.250) lan diukur nganggo kit deteksi DNA untai ganda Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Uji MTS digunakake kanggo ngukur proliferasi sel.Sel disemai pada plat 96 sumur dengan kepadatan awal 2000 sel/sumur.Jumlah relatif sel diukur saben dina ing wektu sing dituduhake kanthi total 4-6 dina.Kanggo saben sumur, 20 μl reagen MTS (Promega) diencerke karo 100 μl DMEM, diinkubasi karo sel kanggo 4 jam ing 37 ° C, lan banjur OD490 diukur.
Kapasitas kanggo pertumbuhan sing ora ana gandhengane ditemokake kanthi nganalisa pembentukan bola.Sedhela, 2000 sel sing ditransfeksi nganggo shRNA DARS-AS1 utawa kontrol shRNA dibudidayakan ing microplates lampiran ultra rendah (Corning) kanthi owah-owahan medium saben 4 dina.Spheroids diitung sawise 14 dina.500 sel sing ditransfeksi nganggo plasmid overexpression DARS-AS1 utawa plasmid kontrol digunakake kanggo tes tambahan, yen cara kasebut ora diganti.
RNA ditranskripsi nggunakake T7 RNA polymerase lan biotin-16-UTP (Roche 1138908910) miturut instruksi Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Primer sing digunakake ing kene kadhaptar ing Tabel Tambahan 4.
Protein-coding PACT utawa wilayah PKR dikloning dadi pET15b (Addgene #73619) lan diowahi dadi BL21 (DE3).Bakteri kasebut diinkubasi sewengi ing LB sing diwenehake karo ampicillin lan banjur diencerake 100 kali karo LB seger.Nalika OD600 saka medium tekan 0,8, 1 mM IPTG ditambahake kanggo ngindhuksi ekspresi protein.Sawise inkubasi sewengi kanthi goyang alus (250 rpm ing 20 ° C), pelet sel dikumpulake kanthi sentrifugasi (4000 rpm, 10 menit, 4 ° C).Resuspend pelet sel ing buffer lisis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) lan inkubasi ing es kanggo 30 menit, banjur sonicate (15 min, 5 s on/off, ing es) lan centrifuge (13.000). rpm)., 30 menit, 4°C).Supernatan kasebut banjur dimuat ing resin Ni-NTA (QIAGEN) 3 kali ing suhu 4 ° C, dicuci 4 kali nganggo buffer wash (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) lan diencerake 3 kali, kanthi total. saka 10 ml buffer eluen (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Protein sing diresiki ditemtokake nggunakake WB lan konsentrasi ditemtokake nggunakake kit uji protein Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Pengujian RIP ditindakake kaya sing wis diterangake sadurunge, kanthi modifikasi.Sedhela, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) lan centrifuge ing 13.000 rpm kanggo 15 menit ing 4 °C.Supernatan kasebut banjur diinkubasi karo protein A+G magnetic beads (Millipore) sing dikonjugasi karo 5 μg antibodi anti-PACT (Abeam) utawa IgG (CST).Manik-manik kasebut dikumbah kaping 5 kanthi buffer RIP 5x, banjur dicerna nganggo proteinase K (NEB).RNA diekstrak karo Trizol lan ditemtokake dening RT-qPCR.Primer ditampilake ing Tabel Tambahan 5.
Pengujian RIP in vitro ditindakake miturut protokol uji RIP standar sing dimodifikasi.Gunggunge 5 pmol RNA sing ditranskripsi in vitro diencerake 1x karo buffer RIP lan anil kanthi inkubasi ing 65 ° C suwene 5 menit banjur didinginkan alon-alon nganti suhu kamar.Gunggunge 5 pmol protein PACT kanthi label gendéra sing utuh utawa mutasi diresiki saka E. coli.Inkubasi nganggo RNA sing wis direnatur sajrone 2 jam ing 4 ° C lan tindakake prosedur ing ndhuwur kanggo analisis RIP kanggo IP anti-flag.
Kanggo analisis ekstensi RNA, sel 1 × 107 dilisis karo buffer 1xRIP.Sawise sentrifugasi ing 13.000 rpm kanggo 15 menit ing 4 ° C, supernatant wis pretreated karo 30 μl streptavidin manik magnetik (Beckman) kanggo 2 jam ing 4 ° C.Lysate sing diresiki banjur disedhiyakake karo tRNA ragi lan diinkubasi karo 40 pmol RNA sing direnatur sewengi ing suhu 4 ° C, banjur ditambahake 2 jam liyane lan 20 μl manik magnetik streptavidin anyar sing diblokir karo BSA ditambahake.Langkah ngumbah kasusun saka 4 kaping karo 5x RIP buffer lan 4 kaping karo 1x RIP buffer.Protein sing cocog diencerake karo buffer elusi biotin (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) lan dipisahake ing NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Sawise pewarnaan perak (Bioteknologi Beyotime), pita tartamtu dipotong lan dianalisis dening MS.
Analisis Co-IP ditindakake kanggo nguji interaksi antarane PACT lan PKR.Sedhela, lysates supernatant disiapake kanthi inkubasi 1 x 107 sel lysed ing 1 x buffer RIP banjur sentrifugasi ing 13.000 rpm kanggo 15 menit ing 4 ° C.Lysates diisi karo protein A + G manik-manik magnetik, dikonjugasi karo 5 µg antibodi anti-PACT, lan alon-alon diputer ing wayah wengi ing 4 ° C.Manik-manik kasebut dikumbah kaping 3 kanthi buffer 5 × RIP, kaping pindho kanthi buffer 1 × RIP lan diencerake nganggo buffer 1 × SDS.Protein sing wis pulih dianalisis nganggo gel SDS-PAGE lan dideteksi dening WB.
Rong pmol saka PACT sing ditandhani lan 1 pmol saka PKR diresiki saka E. coli.Dilute ing 1 × RIP buffer lan inkubasi karo 10 pmol RNA renatured kanggo 2 jam ing 4 ° C.Sawisé iku, padha diinkubasi karo protein A + G magnetik manik-conjugated anti-label antibodi kanggo tambahan rong jam.Manik-manik kasebut banjur dikumbah kaping papat nganggo 1x RIP buffer lan diencerake nganggo 1x SDS buffer.PACT lan PKR sing diasilake dideteksi dening WB.