Kabar

Matur nuwun kanggo ngunjungi Nature.com.Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates.Kanggo pengalaman paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer).Ing sawetoro wektu, kanggo mesthekake dhukungan terus, kita bakal nerjemahake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Cara pelabelan jarak enzimatik adhedhasar ester sing diaktifake utawa radikal phenoxy digunakake akeh kanggo peta proteom subselular lan interaksi protein ing sel urip.Nanging, ester sing diaktifake kurang reaktif, nyebabake radius label sing amba, lan radikal fenoksi sing diasilake dening perawatan peroksida bisa ngganggu jalur redoks.Ing kene, kita nglaporake metode fotoaktivasi gumantung karo label jarak (PDPL) sing dikembangake kanthi ngubungake protein miniSOG photosensitizer kanthi genetik menyang protein sing disenengi.Dipicu dening cahya biru lan dikontrol dening wektu cahya, oksigen singlet kui lan banjur spatiotemporally mantun Labeling saka residu histidine dening probe aniline ngrambah.Kita nduduhake kasetyan sing dhuwur liwat pemetaan proteome khusus organel.Perbandingan sisih-sisih PDPL karo TurboID nuduhake jangkoan proteomik sing luwih spesifik lan komprehensif saka PDPL.Sabanjure, kita ngetrapake PDPL menyang coactivator transkripsi BRD4 lan E3 Parkin ligase sing gegandhengan karo penyakit lan nemokake interaksi sing durung dingerteni sadurunge.Kanthi screening overexpression, rong substrat sing ora dingerteni, Ssu72 lan SNW1, diidentifikasi kanggo Parkin, sing degradasi ditengahi dening jalur ubiquitination-proteasome.
Karakterisasi jaringan protein sing akurat ndasari akeh proses seluler dhasar.Mulane, pemetaan spatiotemporal interaksi protein sing akurat banget bakal nyedhiyakake basis molekuler kanggo deciphering jalur biologi, patologi penyakit, lan ngganggu interaksi kasebut kanggo tujuan terapeutik.Kanggo tujuan iki, cara sing bisa ndeteksi interaksi temporal ing sel utawa jaringan urip pancen dikarepake.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) wis historis digunakake kanggo ngenali partner naleni protein saka kapentingan (POI).Kanthi pangembangan metode proteomik kuantitatif, Bioplex3.0 digawe, basis data jaringan protein paling gedhe adhedhasar AP-MS.Sanajan AP-MS kuat banget, lisis sel lan langkah-langkah pengenceran ing alur kerja bias menyang interaksi ikatan sing lemah lan sementara lan ngenalake artefak pasca-lisis kayata pasangan interaksi palsu sing ora duwe kompartemenisasi sadurunge lisis.
Kanggo ngatasi masalah kasebut, asam amino ora alami (UAA) kanthi klompok sambung silang lan platform labeling cedhak enzimatik (PL) (umpamane APEX lan BioID)5 wis dikembangake.Sanajan cara UAA wis kasil diterapake ing pirang-pirang skenario lan menehi informasi babagan perekat protein langsung, optimasi situs selipan UAA isih dibutuhake.Sing luwih penting, iki minangka metode label stoikiometri sing ora duwe pembalikan katalitik saka acara label.Ing kontras, metode PL enzimatik, kayata metode BioID, nggabungake ligase biotin sing direkayasa dadi POI7, sing banjur ngaktifake biotin kanggo mbentuk perantara ester biotinil-AMP sing reaktif.Enzim kasebut dadi katalis lan ngeculake "awan" biotin sing diaktifake sing menehi label residu lisin proksimal.Nanging, BioID mbutuhake luwih saka 12 jam kanggo entuk sinyal label sing cukup, sing ora bisa digunakake kanthi resolusi temporal.Nggunakake evolusi diarahake adhedhasar tampilan ragi, TurboID dirancang adhedhasar BioID dadi luwih efisien, ngidini labeling efisien karo biotin sajrone 10 menit, ngidini proses sing luwih dinamis ditliti.Amarga TurboID aktif banget lan tingkat biotin endogen cukup kanggo labeling tingkat rendah, label latar mburi dadi masalah potensial nalika labeling sing ditingkatake lan wektune dibutuhake kanthi tambahan biotin eksogen.Kajaba iku, ester sing diaktifake kurang reaktif (t1/2 ~ 5 min), sing bisa nyebabake radius label sing gedhe, utamane sawise jenuh protein tetanggan karo biotin 5. Ing pendekatan liyane, fusi genetik peroksidase askorbat sing direkayasa (yaiku biotin- radikal fenol lan ngidini labeling protein sajrone siji menit9,10 APEX digunakake akeh kanggo ngenali proteom subselular, kompleks protein membran, lan kompleks protein sinyal cytosolic11,12. pangolahan seluler.
Mangkono, cara anyar sing bisa ngasilake spesies penindasan radius label sing luwih reaktif kanthi akurasi spasial lan temporal sing dhuwur tanpa ngganggu jalur seluler kanthi signifikan bakal dadi tambahan penting kanggo metode sing wis ana. Ing antarane spesies reaktif, oksigen singlet narik kawigaten amarga umure cendhak lan radius difusi winates (t1/2 <0.6 µs ing sel)13. Ing antarane spesies reaktif, oksigen singlet narik kawigaten amarga umure cendhak lan radius difusi winates (t1/2 <0.6 µs ing sel)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограгнически, 3 злород из-за его короткого времени жизни и ограгнически / 3 злодного времени и ограгниче/2хлород Antarane bentuk aktif, oksigen singlet narik kawigaten amarga umure cendhak lan radius difusi winates (t1/2 <0.6 µs ing sel)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs／的走他们一们中文。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограници/2 хифкдный. Ing antarane wangun aktif, oksigen singlet narik kawigaten amarga umure cendhak lan radius difusi winates (t1/2 <0,6 μs ing sel).Oksigen tunggal wis dilapurake kanthi acak ngoksidasi methionine, tirosin, histidin lan triptofan, dadi polar 14,15 kanggo lampiran kanggo probes adhedhasar amina utawa thiol16,17.Senajan oksigen singlet wis digunakake kanggo menehi label RNA kompartemen subselular, strategi kanggo repurposing penanda jarak POI endogen tetep durung diteliti.Ing kene, kita nampilake platform sing diarani photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), ing ngendi kita nggunakake lampu biru kanggo madhangi POI sing digabung karo miniSOG photosensitizer lan micu generasi oksigen singlet kanggo ngoksidasi residu proksimal, diikuti karo modifikasi sing ngemot amina kanggo ngoksidasi probe kimia dadi. sel urip penengah..Kita nguji klompok probe kimia kanggo nggedhekake kekhususan tag lan ngenali situs modifikasi nggunakake alur kerja proteomik sing mbukak.Perbandingan sisih-sisih PDPL karo TurboID nuduhake jangkoan proteomik sing luwih spesifik lan komprehensif saka PDPL.Kita ngetrapake pendekatan iki kanggo penanda khusus organel saka proteome subselular lan identifikasi proteome umum saka mitra pengikat kanggo protein regulasi epigenetik sing gegandhengan karo kanker BRD4 lan E3 ligase Parkin sing gegandhengan karo penyakit Parkinson, sing ngonfirmasi jaringan protein sing dikenal lan ora dingerteni. interaksi..Kemampuan PDPL kanggo ngenali substrat E3 ing kompleks protein gedhe nggambarake kahanan sing mbutuhake pangenalan pengikat ora langsung.Loro substrat parkin sing ora dingerteni sing ditengahi dening ubiquitination-proteasome wis dikonfirmasi ing situ.
Terapi fotodinamik (PDT)19 lan inaktivasi laser sing dibantu kromofor (CALI)20, ing endi iradiasi cahya nganggo fotosensitizer ngasilake oksigen singlet, bisa mateni protein target utawa nyebabake pati sel.Wiwit oksigen singlet minangka zat sing reaktif banget kanthi jarak difusi teoritis kira-kira 70 nm, oksidasi winates spasial ing saubengé fotosensitif bisa dikontrol.Adhedhasar konsep iki, kita mutusake nggunakake oksigen singlet kanggo nggayuh labeling kompleks protein ing sel urip.Kita wis ngembangake pendekatan chemoproteomic PDPL kanggo nepaki papat fungsi: (1) kanggo catalyze generasi oksigen singlet aktif padha karo pendekatan enzimatik PL;(2) nyedhiyakake label sing wis ditanggulangi wektu nalika wiwitan cahya;(3) kanthi owah-owahan (4) Aja nggunakake kofaktor endogen (kayata biotin) kanggo nyuda latar mburi, utawa nggunakake reagen eksogen sing banget ngganggu (kayata peroksida) kanggo nyuda paparan sel kanggo stres lingkungan.
Photosensitizers bisa dipérang dadi rong kategori kalebu fluorophores bobot molekul cilik (contone, mawar bengal, methylene blue)22 lan protèin cilik sing dikode sacara genetis (contone miniSOG, KillerRed)23.Kanggo entuk desain modular, kita ngembangake platform PDPL generasi pisanan kanthi nambah protein photosensitizer (PS) menyang POI24,25 (Gambar 1a).Nalika disinari karo cahya biru, oksigen singlet ngoksidasi residu asam amino nukleofilik proksimal, nyebabake polaritas umpolung sing elektrofilik lan bisa luwih bereaksi karo nukleofil probe amine16,17.Probe dirancang kanthi gagang alkuna kanggo ngidini kimia klik lan narik mudhun kanggo karakterisasi LC / MS / MS.
Ilustrasi skematis labeling kompleks protein mediated dening miniSOG.Nalika kapapar cahya biru, sel sing nuduhake miniSOG-POI ngasilake oksigen singlet, sing ngowahi protein sing sesambungan nanging ora protein sing ora ngiket.Produk penengah fotooksidasi dicegat dening label relay saka probe kimia amina kanggo mbentuk adducts kovalen.Gugus alkynyl ing probe kimia ngidini kimia klik kanggo pengayaan dening pull-mudhun ngiring dening LC-MS / MS quantitation.b Struktur kimia probe amina 1-4.c Analisis gel neon perwakilan saka mitokondria localized miniSOG-mediated marker proteomic nggunakake probe 1-4 lan kuantifikasi relatif adhedhasar densitometri gel.Rasio sinyal-kanggo-latar mburi probe kimia ditaksir nggunakake eksperimen kontrol negatif ora kalebu cahya biru utawa nggunakake sel HEK293T tanpa ekspresi miniSOG.n = 2 sampel bebas biologis.Saben titik nggambarake replika biologis.d Deteksi perwakilan lan kuantifikasi PDPL nggunakake probe 3 sing dioptimalake yen ana utawa ora ana komponen PDPL sing dituduhake kaya c.n = 3 sampel bebas biologis.Saben titik nggambarake replika biologis.Garis tengah lan kumis nuduhake rata-rata lan ± simpangan baku.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Pencitraan konfokal oksigen singlet kanthi pewarnaan Si-DMA abang adoh.Skala bar: 10 µm.Pencitraan gel lan eksperimen confocal diulang kanthi mandiri paling ora kaping pindho kanthi asil sing padha.
Kita pisanan nguji kemampuan photosensitizers diwasa miniSOG26 lan KillerRed23, kanthi stabil ing HEK293T, kanggo mediasi label propargylamine saka proteome minangka probe kimia (Tambahan Gambar 1a).Analisis fluoresensi gel nuduhake manawa labeling proteome kabeh digayuh nggunakake miniSOG lan iradiasi cahya biru, nalika ora ana produk label sing katon karo KillerRed.Kanggo nambah rasio sinyal-kanggo-latar mburi, kita banjur nguji pesawat probe kimia sing ngemot aniline (1 lan 3), propylamine (2), utawa benzylamine (4).Kita mirsani yen sel HEK293T dhewe nduweni sinyal latar mburi sing luwih dhuwur tinimbang ora ana cahya biru, bisa uga amarga fotosensitizer riboflavin endogen, flavin mononucleotide (FMN) 27. Probe kimia adhedhasar aniline 1 lan 3 menehi spesifisitas sing luwih apik, kanthi HEK293T kanthi stabil nyatakake miniSOG ing mitokondria sing nuduhake peningkatan > 8-lipat ing sinyal kanggo probe 3, dene probe 2 digunakake ing metode labeling RNA CAP-seq mung nampilake ~2.5- mundhak sinyal melu, kamungkinan amarga pilihan reaktivitas beda antarane RNA lan protein (Fig. 1b, c). Probe kimia adhedhasar aniline 1 lan 3 menehi spesifisitas sing luwih apik, kanthi HEK293T kanthi stabil nyatakake miniSOG ing mitokondria sing nuduhake peningkatan > 8-lipat ing sinyal kanggo probe 3, dene probe 2 digunakake ing metode labeling RNA CAP-seq mung nampilake ~2.5- mundhak sinyal melu, kamungkinan amarga pilihan reaktivitas beda antarane RNA lan protein (Fig. 1b, c).Probe kimia adhedhasar aniline 1 lan 3 nuduhake spesifisitas sing luwih apik: HEK293T, sing kanthi stabil nyatakake miniSOG ing mitokondria, nuduhake luwih saka 8-lipat sinyal kanggo probe 3, nalika probe 2, digunakake ing metode labeling CAP-seq RNA, mung. nuduhake ~ 2,5-melu sinyal mundhak, mbokmenawa amarga pilihan reaktivitas beda antarane RNA lan protein (Fig. 1b, c).基于基于 的 化学化学 1 和 3 具有 更 的 的 特异性, hek293t 在 线 粒体粒体 稳定稳定 minisog, 探针 3 的 信号信号> 8 倍, 的而 于 rna 的标记 的 2 仅 显示 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 的 的 化学化学 1 和 3 具有 更 的 特异性, hek293t 在 粒体粒体 稳定稳定 minisog, 探针 3 的 的信号增加> 8 倍 而 于 于 RNA 的 2 -倍信号增加，可能是由于RNAProbe kimia adhedhasar aniline 1 lan 3 nduweni spesifisitas sing luwih apik, HEK293T kanthi stabil nyatakake miniSOG ing mitokondria, lan probe 3 duwe sinyal luwih saka 8-fold, dene probe 2 kanggo metode labeling CAP-seq RNA mung nuduhake ~ 2.5-lipat.ing sinyal, mbokmenawa amarga pilihan reaksi beda antarane RNA lan protein (Fig. 1b, c).Kajaba iku, probe 3 isomer lan hydrazine probe (probe 5, 6, 7) diuji, ngonfirmasi optimasi probe 3 (Tambahan Gambar 1b, c).Kajaba iku, analisis fluoresensi ing-gel ngandhakake paramèter eksperimen sing dioptimalake liyane: dawa gelombang iradiasi (460 nm), konsentrasi probe kimia (1 mM), lan wektu iradiasi (20 min) (Gambar Tambahan 2a-c).Ngilangi komponen utawa langkah ing protokol PDPL ngasilake sinyal sing signifikan ing latar mburi (Gambar 1d).Utamane, labeling protein dikurangi kanthi signifikan nalika ana sodium azide utawa trolox, sing dikenal kanggo ngilangi oksigen singlet.Anane D2O, sing dikenal kanggo nyetabilake oksigen singlet, nambah sinyal label.Kanggo nyelidiki kontribusi spesies oksigen reaktif liyane kanggo labeling, mannitol lan vitamin C ditambahake kanggo nggawe pemulung radikal hidroksil lan superoksida, 18, 29, nanging ora ditemokake kanggo nyuda label.Penambahan H2O2, nanging ora katerangan, ora nyebabake labeling (Tambahan Gambar 3a).Pencitraan oksigen singlet fluoresensi karo probe Si-DMA dikonfirmasi anané oksigen singlet ing kabel HEK293T-miniSOG, nanging ora ing kabel HEK293T asli.Kajaba iku, mitoSOX Red ora bisa ndeteksi produksi superoksida sawise katerangan (Gambar 1e lan Gambar Tambahan 3b) 30. Data kasebut banget nyatakake yen oksigen singlet minangka spesies oksigen reaktif utama sing tanggung jawab kanggo labeling proteomik sabanjure.Sitotoksisitas PDPL ditaksir kalebu iradiasi cahya biru lan probe kimia, lan ora ana sitotoksisitas sing signifikan (Tambahan Gambar 4a).
Kanggo nyinaoni mekanisme labeling lan ngaktifake identifikasi proteomik kompleks protein nggunakake LC-MS / MS, kita kudu nemtokake asam amino sing diowahi lan massa delta label probe.Methionine, histidine, triptofan lan tirosin wis dilapurake dimodifikasi dening oksigen singlet14,15.Kita nggabungake alur kerja TOP-ABPP31 karo telusuran mbukak tanpa bias sing diwenehake dening platform komputasi FragPipe adhedhasar MSFragger32.Sawise modifikasi oksigen singlet lan pelabelan probe kimia, kimia klik ditindakake kanthi nggunakake label pengurangan biotin sing ngemot linker sing bisa dibelah, diikuti peregangan neutravidin lan pencernaan trypsin.Peptida sing diowahi, isih kaiket ing resin, fotocleaved kanggo analisis LC-MS / MS (Gambar 2a lan Data Tambahan 1).A nomer akeh modifikasi dumadi ing saindhenging proteome karo liwat 50 peta peptida (PSM) cocog kadhaptar (Fig. 2b).Kaget, kita mung mirsani modifikasi histidine, mbokmenawa amarga reaktivitas histidine teroksidasi sing luwih dhuwur marang probe aniline tinimbang asam amino liyane.Miturut mekanisme oksidasi histidin sing diterbitake dening oksigen singlet, 21,33 struktur massa delta sing diusulake saka +229 Da cocog karo adduksi probe 3 karo 2-oxo-histidine sawise rong oksidasi, dene +247 Da minangka produk hidrolisis. saka +229 Da (Tambahan Gambar 5).Evaluasi spektrum MS2 nuduhake reliabilitas dhuwur saka identifikasi paling akeh ion y lan b, kalebu identifikasi ion fragmen sing diowahi (y lan b) (Gambar 2c).Analisis konteks saka urutan lokal histidine sing diowahi PDPL ngungkapake preferensi motif moderat kanggo residu hidrofobik cilik ing posisi ± 1 (Tambahan Gambar 4b).Rata-rata, 1.4 histidine diidentifikasi saben protein, lan situs tandha kasebut ditemtokake dening area permukaan sing bisa diakses pelarut (SASA) lan analisis kasedhiyan pelarut relatif (RSA) (Tambahan Gambar 4c, d).
Alur kerja sing ora bias kanggo sinau selektivitas residual nggunakake platform komputasi FragPipe sing didhukung dening MSFragger.Linkers cleavable digunakake ing kimia Klik kanggo ngidini photocleavage saka peptida dipunéwahi saka resin streptavidin.Panelusuran mbukak diluncurake kanggo ngenali akeh modifikasi, uga sisa sing relevan.b Nemtokake massa modifikasi sing dumadi ing saindhenging proteome.Pemetaan peptida PSM.c. Anotasi spektral MS2 situs histidine sing diowahi nganggo probe 3. Minangka conto perwakilan, reaksi kovalen karo probe 3 ditambahake +229,0938 Da menyang asam amino sing diowahi.d Uji mutasi digunakake kanggo nguji panandha PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) lan PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ditransfeksi nganggo plasmid jinis liar kanggo deteksi anti-Flag.Peptida sintetik direaksikan karo miniSOG sing diresiki ing ngarsane probe 3 lan produk sing cocog karo Δm +247 lan +229 dicathet ing spektrum LC-MS.f Interaksi protein-kanggo-protein in vitro dimodelake karo miniSOG-6xHis-tag lan antibodi anti-6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) lan analisis Western blot anti-mouse saka kompleks antibodi miniSOG-6xHis / anti-6xHis sing dilabel karo probe 3, gumantung saka wektu cahya.Label kanggo protein individu ditulis ing bobot molekul sing cocog: rantai cahya antibodi LC, rantai abot antibodi HC.Eksperimen kasebut diulang kanthi mandiri paling ora kaping pindho kanthi asil sing padha.
Kanggo verifikasi biokimia saka situs label, PRDX3 lan PRDX1 sing diidentifikasi kanthi spektrometri massa diganti saka histidine dadi alanin lan dibandhingake karo jinis liar ing tes transfeksi.Asil PDPL nuduhake yen mutasi kanthi signifikan nyuda labeling (Gambar 2d).Sauntara kuwi, urutan peptida sing diidentifikasi ing telusuran mbukak disintesis lan reaksi in vitro kanthi miniSOG sing diresiki ing ngarsane probe 3 lan cahya biru, ngasilake produk kanthi pergeseran massa +247 lan +229 Da nalika dideteksi dening LC-MS (Fig). . 2e).).Kanggo nguji manawa protein proksimal sing sesambungan bisa diwenehi label in vitro kanggo nanggepi fotoaktivasi miniSOG, kita ngrancang uji jarak gawean kanthi interaksi antarane protein miniSOG-6xHis lan antibodi monoklonal anti-His in vitro (Gambar 2f).Ing tes iki, kita ngarepake label proksimal saka rantai abot lan entheng antibodi kanthi miniSOG.Nyatane, anti-mouse (ngerteni rantai abot lan entheng antibodi anti-6xHis-label) lan streptavidin Western blots nuduhake biotinilasi kuwat saka rantai abot lan entheng.Utamane, kita weruh autobiotinylation miniSOG amarga tag 6xHis lan link silang antarane rantai entheng lan abot, sing bisa uga ana hubungane karo celah sing diterangake sadurunge antarane lisin lan respon proksimal 2-oxo-histidine.Ing kesimpulan, kita nyimpulake yen PDPL ngowahi histidine kanthi cara sing gumantung ing jarak.
Tujuan sabanjure yaiku kanggo menehi ciri proteome subselular kanggo nguji spesifik labeling in situ.Mulane, kita kanthi stabil nyatakake miniSOG ing inti, matriks mitokondria, utawa membran ER njaba sel HEK293T (Gambar 3a).Analisis fluoresensi gel ngungkapake pita label sing akeh banget ing telung lokasi subselular uga pola label sing beda (Fig. 3b).Analisis pencitraan fluoresensi nuduhake kekhususan dhuwur saka PDPL (Gambar 3c).Alur kerja PDPL diterusake kanthi reaksi klik karo pewarna rhodamine kanggo nggambarake proteom subselular nggunakake mikroskop fluoresensi, lan sinyal PDPL dikolokalisasi karo DAPI, pelacak mitokondria, utawa pelacak ER, ngonfirmasi kesetiaan PDPL sing dhuwur.Kanggo telung lokasi organelle, comparison sisih-by-side saka PDPL karo TurboID nggunakake avidin western blot nuduhake yen PDPL iki labeled luwih khusus dibandhingake kontrol pamilike.Ing kahanan PDPL, luwih akeh pita label katon, nuduhake luwih akeh protein label PDPL (Tambahan Gambar 6a-d).
Perwakilan skematis saka label proteome khusus organel sing dimediasi miniSOG.miniSOG ngarahake matriks mitokondria liwat fusi menyang N-terminal 23 asam amino manungsa COX4 (mito-miniSOG), nukleus liwat fusi menyang H2B (nukleus-miniSOG), lan Sec61β liwat sisih sitoplasma saka membran ER (ER-miniSOG). ).Indikasi kalebu pencitraan gel, pencitraan confocal, lan spektrometri massa.b Gambar gel wakil saka telung profil PDPL organelle-tartamtu.CBB Coomassie Sarwa Biru.c Gambar confocal perwakilan saka sel HEK293T kanthi stabil nyatakake miniSOG kanthi lokalisasi subseluler sing beda-beda sing dideteksi dening antibodi kanthi label V5 (abang).Tandha subselular digunakake kanggo mitokondria lan ER (ijo).Alur kerja PDPL kalebu deteksi miniSOG (kuning) kanthi label proteom subselular kanthi nggunakake kimia klik Cy3-azide.Skala bar: 10 µm.d Plot vulkanik saka proteomes sing diwenehi tag PDPL ing macem-macem organel sing diukur kanthi kuantifikasi tanpa label (n = 3 eksperimen biologi independen).Uji t Student two-tailed digunakake ing plot gunung geni.HEK293T jinis alam bébas digunakake minangka kontrol negatif. Protein sing diganti kanthi signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan> prabédan intensitas ion 2 kali lipat). Protein sing diganti kanthi signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan> prabédan intensitas ion 2 kali lipat). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protein sing diowahi sacara signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan> prabédan intensitas ion luwih saka 2 kali).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protein sing diowahi sacara signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan > prabédan 2 kali lipat ing kekuatan ion).Protein sing gegandhengan penting kanggo HEK293T-miniSOG nanging ora penting kanggo HEK293T ditampilake ing ijo.e Analisis kekhususan dataset proteomik saka eksperimen d.Jumlah total protein sing signifikan sacara statistik ing saben organel (titik abang lan ijo) ditandhani ing ndhuwur.Histogram nuduhake protein sing dilokalisasi ing organel adhedhasar MitoCarta 3.0, analisis GO lan A. Ting et al.wong.Dataset kapisah kanggo mitokondria, inti, lan ER.Eksperimen kasebut diulang kanthi mandiri paling ora kaping pindho kanthi asil sing padha.Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.
Didhukung dening asil gel lan pencitraan, kuantifikasi bebas label digunakake kanggo ngitung protein sing diidentifikasi ing saben organel (Data Tambahan 2).HEK293T sing ora ditransfeksi digunakake minangka kontrol negatif kanggo nyuda tandha latar mburi. Analisis plot gunung geni nampilake protein sing diperkaya sacara signifikan (p <0,05 lan> intensitas ion 2 kali lipat) uga protein tunggal sing mung ana ing garis ekspresi miniSOG (Gambar 3d titik abang lan ijo). Analisis plot gunung geni nampilake protein sing diperkaya sacara signifikan (p <0,05 lan> intensitas ion 2 kali lipat) uga protein tunggal sing mung ana ing garis ekspresi miniSOG (Gambar 3d titik abang lan ijo). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analisis plot gunung geni nuduhake protein sing diperkaya sacara signifikan (p<0,05 lan> intensitas ion 2 kali lipat) uga protein tunggal sing mung ana ing garis ekspresi miniSOG (Gambar 3d, titik abang lan ijo).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 (p <0,05 和> 2 倍 离子 强度) 以及以及 存存 在于在于 的中 的 单一单一 (图 3D)).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子离子) 仅仅 的在于 minisog 表达 系 的 红色单一 (图 3D Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analisis plot gunung geni nuduhake protein sing diperkaya sacara signifikan (p<0,05 lan> 2x kekuatan ion) uga protein tunggal mung ana ing garis ekspresi miniSOG (titik abang lan ijo ing Fig. 3d).Nggabungake data kasebut, kita ngidhentifikasi 1364, 461, lan 911 protein membran njaba nuklir, mitokondria, lan ER sing signifikan sacara statistik.Kanggo nganalisa akurasi PDPL organel-lokal, kita nggunakake MitoCarta 3.0, analisis Gene Ontology (GO), lan A. Ting et al.set data8 digunakake kanggo mitokondria, nukleus, lan ER kanggo nguji kekhususan organel saka protein sing dideteksi, cocog karo akurasi 73,4, 78,5, lan 73,0% (Gambar 3e).Spesifisitas PDPL negesake manawa PDPL minangka alat sing cocog kanggo ngenali proteom spesifik organel.Utamane, analisis submitochondrial saka protein mitokondria sing diidentifikasi nuduhake yen proteome sing kepepet utamane disebarake ing matriks lan membran batin (masing-masing 226 lan 106), nyatakake 91,7% (362) saka total protein mitokondria sing diidentifikasi.tingkat dhuwur saka PDPL iki tambahan dikonfirmasi (Tambahan Fig. 7a).Kajaba iku, analisis subnuklear nuduhake yen proteome sing dijupuk utamane disebarake ing nukleus, nukleoplasma, lan nukleolus (Tambahan Gambar 7b).Analisis proteomik nuklir kanthi peptida sinyal lokalisasi nuklir (3xNLS) nuduhake akurasi sing padha karo konstruksi H2B (Tambahan Gambar 7c-h).Kanggo nemtokake spesifisitas penanda PDPL, laminin nuklir A dipilih minangka trap POI7 sing luwih diskret.PDPL dikenali 36 protèin sugih Ngartekno, kang 12 protèin (30,0% kalebu lamin A) padha uga-ditandai lamin A interaksi protein annotated dening database String, karo persentasi luwih saka cara BioID (122 protein) 28 saka 28. , 22.9 %) 7. Cara kita ngenali protein sing luwih sithik, bisa uga amarga wilayah label sing winates, sing bisa ditindakake kanthi oksigen singlet sing luwih aktif.Analisis GO nuduhake yen protein sing diidentifikasi utamane ana ing nukleoplasma (26), membran nuklir (10), membran nuklir (9), lan pori-pori nuklir (5).Secara kolektif, protèin sing dilokalisasi nuklir iki nduwèni 80% saka protèin sing diperkaya, luwih nduduhake kekhususan PDPL (Tambahan Gambar 8a-d).
Sawise netepake kemampuan PDPL kanggo nindakake tandha jarak ing organel, kita banjur nyoba apa PDPL bisa digunakake kanggo nganalisa mitra pengikat POI.Utamane, kita ngupaya kanggo nemtokake analisis PDPL saka protein sitosolik, sing dianggep minangka target sing luwih angel tinimbang mitra sing dilokalisasi membran amarga sifate dinamis banget.Protein bromodomain lan extraterminal (BET) BRD4 wis narik kawigaten kita amarga peran kunci ing macem-macem penyakit 35, 36.Komplek sing dibentuk dening BRD4 minangka coactivator transkripsional lan target terapeutik sing penting.Kanthi ngatur ekspresi faktor transkripsi c-myc lan Wnt5a, BRD4 dianggep minangka penentu utama leukemia myeloid akut (AML), multiple myeloma, limfoma Burkitt, kanker usus besar lan penyakit inflamasi37,38.Kajaba iku, sawetara virus target BRD4 kanggo ngatur transkripsi virus lan seluler, kayata papillomavirus, HIV, lan SARS-CoV-236,39.
Kanggo peta interaksi BRD4 nggunakake PDPL, kita gabungke miniSOG karo N- utawa C-terminal isoform cendhak BRD4.Asil proteomik ngungkapake tingkat tumpang tindih ing antarane rong konstruksi kasebut (Tambahan Gambar 9a).Proteome nuklir sing diidentifikasi karo miniSOG-H2B nyakup 77,6% protein sing sesambungan karo BRD4 (Tambahan Gambar 9b).Banjur, wektu cahya sing beda-beda (2, 5, 10, 20 min) digunakake kanggo nyetel radius panandha (Gambar 4a lan data tambahan 3).Kita nyimpulake yen ing fotoperiode sing luwih cendhek, PDPL utamane bakal menehi label mitra pengikat langsung, dene wektu sing luwih suwe bakal kalebu protein sing diidentifikasi sajrone periode fotoaktivasi sing luwih cendhek uga target ora langsung ing kompleks label.Nyatane, kita nemokake tumpang tindih sing kuat antarane titik wektu sing cedhak (84.6% kanggo 2 lan 5 min; 87.7% kanggo 5 lan 10 min; 98.7% kanggo 10 lan 20 min) (Gambar 4b lan Gambar Tambahan 9c).Ing kabeh klompok eksperimen, kita nemokake ora mung BRD4 self-labeling, nanging sawetara target dikenal kayata MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, lan HMGB1 annotated ing database string.Kekuwatan ion saka target kasebut sebanding karo wektu cahya (Gambar 4c lan Gambar Tambahan 9d).Analisis GO saka protein sing diidentifikasi ing klompok 2 menit nuduhake yen protein sing diidentifikasi dilokalisasi ing inti lan melu remodeling kromatin lan fungsi polimerase RNA.Fungsi molekuler protein diperkaya ing ikatan kromatin utawa koaktivasi transkripsi, konsisten karo fungsi BRD4 (Gambar 4d).Analisis interaksi protein sing didhukung basis data string ngandhakake tingkat interaksi ora langsung antarane BRD4 lan HDAC kompleks interaksi kulawarga kayata SIN3A, NCOR2, BCOR, lan SAP130 (Gambar 4e lan Gambar Tambahan 9e), konsisten karo BRD4 lan HDAC histones acetylated binding ..Kajaba iku, target wakil sing diidentifikasi dening LC-MS / MS, kalebu Sin3A, NSUN2, Fus, lan SFPQ, dikonfirmasi dening Western blotting (Fig. 4f).Bubar, isoform cendhak BRD4 wis kacarita mbentuk inti kanthi sifat pamisahan fase cair-cair (LLPS).Protein pengikat RNA Fus lan SFPQ mediasi LLPS saka macem-macem proses seluler lan wis diidentifikasi ing kene minangka protein pengikat BRD4 sing ora kacathet.Interaksi antarane BRD4 lan SFPQ dikonfirmasi dening eksperimen co-immunoprecipitation (co-IP) (Gambar 4g), nyaranake mekanisme liya kanggo pemisahan fase cair-cairan BRD4 sing kudu diselidiki luwih lanjut.Digabungake, asil kasebut nuduhake yen PDPL minangka platform sing cocog kanggo ngenali interaksi BRD4 sing dikenal uga protein pengikat sing ora dingerteni.
Perwakilan skematis saka tandha jarak BRD4 sing dimediasi miniSOG, wektu cahya: 2, 5, 10, lan 20 min.b Tumpang tindih protein sing diidentifikasi ing wektu katerangan sing beda.Pengayaan protein sing diidentifikasi ing HEK293T-miniSOG-BRD4 signifikan sacara statistik dibandhingake HEK293T jinis liar.c Intensitas ion nalika ngitung perwakilan tanpa label sing dikenal minangka protein pengikat BRD4 sajrone wektu cahya sing ditemtokake.n = 3 sampel bebas biologis.Data dipunandharaken kanthi rata-rata ± standar deviasi.d Analisis ontologis gen (GO) protein sing diidentifikasi ing klompok 2 menit.Sepuluh istilah GO pisanan didaftar.Gelembung diwarnai miturut kategori istilah GO, lan ukuran gelembung sebanding karo jumlah protein sing ditemokake ing saben istilah.e Analisis string protein sing sesambungan karo BRD4.Lingkaran kuning minangka lem langsung lan bunderan abu-abu minangka lapisan pertama lem ora langsung.Garis abang nggambarake interaksi sing ditemtokake kanthi eksperimen lan garis biru nggambarake interaksi sing diramalake.f Representative BRD4 naleni target dikenali ing LC-MS / MS wis diverifikasi dening Western blotting.g Eksperimen Co-immunoprecipitation konfirmasi interaksi antarane SFPQ lan BRD4.Eksperimen kasebut diulang kanthi mandiri paling ora kaping pindho kanthi asil sing padha.Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.
Saliyane kanggo ngenali target sing ora kadhaptar POI-related, kita hypothesize sing PDPL bakal cocok kanggo ngenali substrat kanggo enzim, kang mbutuhake karakterisasi saka protein naleni ora langsung ing Komplek gedhe kanggo annotate substrat ora kadhaptar.Parkin (dienkode dening PARK2) minangka ligase E3 lan mutasi ing parkin dikenal nyebabake penyakit Parkinson remaja resesif autosomal (AR-JP)42.Kajaba iku, parkin wis diterangake minangka penting kanggo mitophagy (mitochondrial autophagy) lan mbusak spesies oksigen reaktif.Nanging, sanajan sawetara substrat parkin wis diidentifikasi, peran parkin ing penyakit iki tetep ora jelas.Kanggo menehi annotate substrat sing ora ditemtokake, PDPL diuji kanthi nambahake miniSOG menyang N- utawa C-terminus parkin.Sel diobati nganggo transporter proton karbonil sianida m-chlorophenylhydrazone (CCCP) kanggo ngaktifake parkin liwat jalur PINK1-Parkin.Dibandhingake karo asil BRD4 PDPL, gabungan N-terminus parkin nuduhake protein target sing luwih gedhe, sanajan nutupi bagean C-terminus sing luwih gedhe (177 saka 210) (Gambar 5a, b lan Data Tambahan 4).asil konsisten karo laporan sing tag N-terminal bisa aberrantly ngaktifake Parkin44.Kaget, mung ana 18 protein sing tumpang tindih ing data kita kanthi asil AP-MS sing diterbitake kanggo Parkin43, kemungkinan amarga beda antarane garis sel lan alur kerja proteomik.Saliyane papat protein sing dikenal (ARDM1, HSPA8, PSMD14, lan PSMC3) sing diidentifikasi kanthi rong cara (Fig. 5c)43.Kanggo luwih validasi asil LC-MS / MS, perawatan PDPL lan blotting Western sakteruse digunakake kanggo mbandhingaké asil saka HEK293T sel sepah assay lan line parkin N-terminal stabil.Target sing durung dingerteni CDK2, DUT, CTBP1, lan PSMC4 dites nganggo binder sing dikenal, DNAJB1 (Gambar 5d).
Plot gunung berapi protein sing berinteraksi karo parkin ing sel HEK293T kanthi miniSOG sing diekspresikan kanthi stabil digabung karo terminal N- utawa C-parkin (n = 3 eksperimen biologi independen).Uji t Student two-tailed digunakake ing plot gunung geni.HEK293T digunakake minangka kontrol negatif. Protein sing diganti kanthi signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan> prabédan intensitas ion 2 kali lipat). Protein sing diganti kanthi signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan> prabédan intensitas ion 2 kali lipat). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Protein sing diowahi sacara signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan> prabédan intensitas ion luwih saka 2 kali).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Protein sing diowahi sacara signifikan disorot kanthi warna abang (p <0,05 lan > prabédan 2 kali lipat ing kekuatan ion).Protein sing gegandhengan penting kanggo HEK293T-miniSOG nanging ora penting kanggo HEK293T ditampilake ing ijo.b diagram Venn nuduhake protein tumpang tindih antarane N-terminal lan C-terminal mbangun.N-terminal tags bisa aberrantly ngaktifake parkin lan asil ing protein luwih dikenali.c diagram Venn nuduhake protein tumpang tindih antarane PDPL lan AP-MS.Interaksi sing dikenal didaftar, kalebu 4 saka 18 protein sing tumpang tindih lan 11 saka 159 protein sing diidentifikasi khusus ing PDPL.d Representative target dikenali dening LC-MS / MS wis diverifikasi dening Western blotting.e Ssu72 lan SNW1 diidentifikasi minangka substrat parkin sing ora kadhaptar.Plasmid protein sing ditandhani FLAG iki ditransfer menyang HEK293T lan HEK293T-Parkin-miniSOG diikuti perawatan CCCP ing macem-macem titik wektu.Degradasi kasebut luwih jelas ing garis overexpression Parkin.f Nggunakake inhibitor proteasome MG132, dikonfirmasi yen proses degradasi Ssu72 lan SNW1 ditengahi dening proteasome-ubiquitination.Eksperimen kasebut diulang kanthi mandiri paling ora kaping pindho kanthi asil sing padha.Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.
Utamane, protein sing diidentifikasi dening PDPL kudu kalebu protein pengikat parkin lan substrate.Kanggo ndeteksi substrat parkin sing ora kadhaptar, kita milih pitung protein sing diidentifikasi (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 lan SNW1) lan plasmid sing ditransfeksi kanggo mbabarake gen kasebut menyang HEK293T normal lan kanthi stabil nyatakake miniSOG-Parkin HEK293T kanthi perawatan CCCP.Tingkat protein Ssu72 lan SNW1 dikurangi sacara signifikan ing garis miniSOG-Parkin sing stabil (Gambar 5e).Perawatan karo CCCP sajrone 12 jam nyebabake degradasi paling signifikan saka loro substrat kasebut.Kanggo neliti apa degradasi Ssu72 lan SNW1 diatur dening proteasome-ubiquitination, inhibitor proteasome MG132 ditambahake kanggo nyegah aktivitas proteasome, lan nyatane kita nemokake yen proses degradasi kasebut dicegah (Gambar 5f).Target non-substrat tambahan dikonfirmasi minangka interaksi Parkin nggunakake Western blotting (Tambahan Gambar 10), sing nuduhake asil konsisten karo LC-MS / MS.Kesimpulane, integrasi alur kerja PDPL kanthi verifikasi transfeksi protein target ngidini identifikasi substrat ligase E3 sing ora kadhaptar.
Kita wis ngembangake platform tandha jarak umum sing ngidini sampeyan ngenali POI sing sesambungan ing ruang lan wektu.Platform kasebut adhedhasar protein fotosensitizer miniSOG, sing mung udakara 12 kDa, kurang saka setengah ukuran enzim APEX2 sing wis diwasa (27 kDa) lan siji katelu ukuran TurboID (35 kDa).Ukuran sing luwih cilik kudu nggedhekake sawetara aplikasi kanggo sinau interaksi protein cilik.Eksplorasi fotosensitizer tambahan, apa protein sing dikode sacara genetis utawa molekul cilik, dibutuhake kanggo nambah asil kuantum oksigen singlet lan nggedhekake sensitivitas pendekatan iki.Kanggo versi miniSOG saiki, résolusi temporal sing dhuwur bisa digayuh nggunakake katerangan biru kanggo ngaktifake penanda jarak.Kajaba iku, wektu cahya sing luwih suwe ngeculake "awan" oksigen singlet sing luwih gedhe, nyebabake modifikasi residu histidine sing luwih distal, radius label sing tambah, lan kemampuan kanggo nyetel resolusi spasial PDPL.Kita uga nguji pitung probe kimia kanggo nambah rasio sinyal-kanggo-latar mburi lan njelajah mekanisme molekul ing mburi pendekatan iki.Alur kerja TOP-ABPP sing digabungake karo telusuran terbuka sing ora bias dikonfirmasi manawa modifikasi mung ana ing histidines lan ora ana lingkungan mikro sing konsisten sing diamati kanggo modifikasi histidine sing tambah, kajaba kanggo preferensi moderat kanggo histidines ing wilayah loop.
PDPL uga wis digunakake kanggo menehi ciri proteom subselular kanthi spesifik lan jangkoan proteome paling ora bisa dibandhingake karo label kedekatan liyane lan metode pemeriksaan kimia khusus organel.Penanda jarak uga wis kasil digunakake kanggo menehi ciri permukaan, lisosom, lan proteomes sing ana hubungane karo secretome46,47.Kita percaya yen PDPL bakal kompatibel karo organel subselular kasebut.Kajaba iku, kita nantang PDPL kanthi ngenali target kanggo ikatan protein sitosol sing luwih kompleks tinimbang protein sing kaiket membran amarga sifat dinamis lan keterlibatan ing interaksi sing luwih temporal.PDPL ditrapake kanggo rong protein, coactivator transkripsi BRD4 lan ligase E3 Parkin sing gegandhengan karo penyakit.Rong protein kasebut dipilih ora mung kanggo fungsi biologis dhasar, nanging uga kanggo relevansi klinis lan potensial terapeutik.Kanggo loro POI kasebut, mitra pengikat sing kondhang uga target sing ora kadhaptar diidentifikasi.Utamane, protein SFPQ sing ana hubungane karo pemisahan fase dikonfirmasi dening co-IP, sing bisa uga nuduhake mekanisme anyar sing BRD4 (isoform cendhak) ngatur LLPS.Ing wektu sing padha, kita percaya yen identifikasi substrat Parkin minangka skenario sing dibutuhake identifikasi adhesive ora langsung.Kita nemtokake rong substrat parkin sing ora dingerteni lan ngonfirmasi degradasi ing sadawane jalur ubiquitination-proteasome.Bubar, strategi jebakan adhedhasar mekanisme wis dikembangake kanggo ndeteksi substrat hidrolase kanthi njebak karo enzim.Sanajan iki minangka cara sing kuat banget, ora cocog kanggo analisis substrat sing ana ing pambentukan kompleks gedhe lan mbutuhake pembentukan ikatan kovalen ing antarane enzim lan substrat.Kita ngarepake yen PDPL bisa ditambahake kanggo nyinaoni kompleks protein lan kulawarga enzim liyane, kayata kulawarga deubiquitinase lan metalloprotease.
Wangun miniSOG anyar, sing diarani SOPP3, wis dikembangake kanthi produksi oksigen singlet sing luwih apik.Kita mbandhingake miniSOG karo SOPP3 lan nemokake kinerja tandha sing luwih apik, sanajan rasio sinyal-kanggo-noise tetep ora owah (Tambahan Gambar 11).Kita duwe hipotesis manawa optimalisasi SOPP3 (umpamane, liwat evolusi terarah) bakal ngasilake protein fotosensitizer sing luwih efisien sing mbutuhake wektu cahya sing luwih cendhek lan ngidini proses seluler sing luwih dinamis bisa dijupuk.Utamane, versi PDPL saiki diwatesi ing lingkungan seluler amarga mbutuhake katerangan cahya biru lan ora bisa nembus jaringan jero.Fitur iki nyegah panggunaan ing studi model kewan.Nanging, kombinasi optogenetik karo PDPL bisa menehi kesempatan kanggo riset kewan, utamane ing otak.Kajaba iku, photosensitizers infra merah rekayasa liyane uga mbusak watesan iki.Riset saiki lagi ditindakake ing wilayah iki.
Garis sel HEK293T dipikolehi saka ATCC (CRL-3216).Garis sel dites negatif kanggo infeksi mycoplasma lan dibudidayakan ing DMEM (Thermo, #C11995500BT) ditambah karo 10% serum sapi janin (FBS, Vistech, #SE100-B) lan 1% penisilin / streptomycin (Hyclone, #SV30010).thukul ing.
3-Aminophenylene (sample 3) lan (4-ethynylphenyl) metanamine (sample 4) dituku saka Bidepharm.Propylamine (probe 2) dituku saka Energi-kimia.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) disintesis miturut metode sing diterbitake.
Tabel Tambahan 1 nampilake konstruksi genetik sing digunakake ing panliten iki.Urutan miniSOG lan KillerRed dikloning saka plasmid hadiah saka P. Zou (Universitas Peking).Urutan penargetan matriks mitokondria asalé saka 23 asam amino terminal N COX4 lan dikloning menyang vektor sing dituduhake kanthi nggunakake rakitan Gibson (Beyotime, #D7010S).Kanggo target membran lan inti retikulum endoplasma, SEC61B DNA manungsa (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) digedhekake dening PCR saka perpustakaan cDNA saka sel HEK293T, lan DNA H2B (disusun dening D. Lin, Laboratorium Teluk Shenzhen) lan kloning, kaya kasebut ing ndhuwur.Yen ora dituduhake, gen protein liyane sing digunakake kanggo transfeksi lan pambangunan garis sel sing stabil digedhekake PCR saka perpustakaan cDNA sel HEK293T.G3S (GGGS) lan G4S (GGGGS) digunakake minangka penghubung antarane protein umpan lan miniSOG.Tag epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) ditambahake ing konstruksi gabungan kasebut.Kanggo ekspresi ing mamalia lan kanggo nggawe garis sel sing stabil, konstruksi gabungan miniSOG disubklonake menyang vektor lentiviral pLX304.Kanggo ekspresi bakteri, miniSOG dikloning menyang vektor pET21a kanthi label 6xHis ing terminal C.
Sel HEK293T diselehake ing 2,0 x 105 sel saben sumur ing piring enem sumur lan ditransfeksi 24 jam sabanjure kanthi plasmid lentiviral rekombinan (2,4 μg pLX304) lan plasmid kemasan virus (1,5 μg psPAX2 lan 1,2 μg pMD2.G00) , #C0533), kira-kira 80% fusi.Sawise transfeksi sewengi, medium diganti lan diinkubasi sajrone 24 jam maneh.Koleksi virus kasebut ditindakake sawise 24, 48 lan 72 jam.Sadurunge infeksi garis sel target, medium virus disaring liwat filter 0,8 μm (Merck, #millex-GP) lan polybrene (Solarbio, #H8761) ditambahake menyang konsentrasi 8 μg / ml.Sawise 24 jam, sel diidini pulih kanthi ngganti medium.Sel dipilih nggunakake 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) kanggo telung perangan pisanan minangka pilihan kenceng sing luwih murah.Banjur digunakake 20 μg / ml minangka regimen sing luwih ketat kanggo telung bagean sabanjure.
Sel ditanem ing kamar 12 sumur (Ibidi, #81201) kanthi kapadhetan kira-kira 20.000 sel saben sumur.Kanggo nambah adhesi sel HEK293T, tambahake 50 µg/ml fibronektin (Corning, #356008) sing diencerake ing saline buffer fosfat (PBS, Sangon, #B640435) ing suhu 37°C.Kamar kasebut pretreated sajrone 1 jam lan banjur dicopot nganggo PBS.Sawise 24 jam, sel wis dikumbah sapisan nganggo PBS, diinkubasi nganggo probe 1 mM 3 ing larutan uyah seimbang Hanks seger (HBSS, Gibco, #14025092) suwene 1 jam ing 37 ° C, banjur diinkubasi nganggo LED biru (460 nm). ).) disinari nganti 10 menit ing suhu kamar.Sawisé iku, sel wis dicuci kaping pindho karo PBS lan tetep karo 4% formaldehida ing PBS (Sangon, #E672002) kanggo 15 menit ing suhu kamar.Formaldehida sing berlebihan dibuang saka sel tetep kanthi ngumbah kaping telu nganggo PBS.Sel-sel banjur permeabilisasi karo 0,5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) ing PBS lan dikumbah kaping 3 nganggo PBS.Banjur copot kamar lan tambahake kanggo saben sampel 25 µl campuran reaksi klik sing ngemot 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) lan 0,5 mg / ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) lan inkubasi kanggo 30 menit ing suhu kamar.Sawise reaksi sworo seru, sel dikumbah kaping enem kanthi PBS sing ngemot 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) lan banjur diblokir nganggo 5% BSA (Abcone, #B24726) ing PBST suwene 30 menit ing suhu kamar.
Kanggo immunostaining colocalization, sel diinkubasi karo antibodi primer miturut kondisi sing dituduhake: mouse anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), terwelu anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), terwelu polyclonal anti-calnexin antibodi (1: 500, Abcam, #ab22595) utawa terwelu anti-lamin A / C antibodi monoklonal (1: 500; CST, #2032) ing 4 °C sewengi.Sawise ngumbah 3 kaping karo PBST, sel inkubasi karo antibodi sekunder: wedhus anti-terwelu Alexa Fluor 488 (Thermo, # A11034) diencerke 1:1000, wedhus anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diencerke 1:1000.dilution Dilute ing suhu kamar kanggo 30 menit.Sel banjur dikumbah kaping 3 nganggo PBST lan dilawan nganggo DAPI (Thermo, #D1306) ing PBS suwene 10 menit ing suhu kamar.Sawise 3 wisuh karo PBS, sel disegel ing 50% gliserol (Sangon, #A600232) ing PBS kanggo imaging.Gambar immunofluoresensi dijupuk nggunakake mikroskop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 lan piranti lunak ZNE 3.5.
Kanggo pencitraan neon oksigen singlet, sel dikumbah kaping pindho nganggo buffer Hanks HEPES sadurunge nambahake 100 nM Si-DMA ing buffer Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Sawise kena cahya, sel kasebut diinkubasi ing inkubator CO2 kanthi suhu 37 ° C suwene 45 menit.Sel-sel banjur dikumbah kaping pindho nganggo buffer HEPES Hanks lan counterstained karo Hoechst ing buffer HEPES Hanks sajrone 10 menit ing suhu kamar lan digambarake nggunakake mikroskop confocal ZEISS LSM 900., #M36008) ing buffer HBSS sing ngemot kalsium lan magnesium.Sawise cahya utawa doxorubicin (MCE, #HY-15142A), sel diinkubasi ing inkubator CO2 ing suhu 37 ° C kanggo 10 menit, dikumbah kaping pindho nganggo buffer HBSS, lan diinkubasi karo Hoechst ing buffer HBSS ing suhu kamar.menit.Doxorubicin digunakake minangka kontrol probe positif ing ngendi sel diobati karo 20 μM doxorubicin ing HBSS sing ngemot 1% BSA sajrone 30 menit.Gambar immunofluoresensi dijupuk nggunakake mikroskop confocal Zeiss LSM 900.
Sel HEK293T kanthi stabil nyatakake mito-miniSOG dibiji kanthi kapadhetan kira-kira 30% ing piring 15 cm.Sawise 48 jam, nalika ~ 80% confluence tekan, sel wis dikumbah sapisan karo PBS, inkubasi karo 1 mM Probe 3 ing buffer HBSS seger ing 1 jam ing 37 ° C lan banjur dipadhangi lampu LED biru kanggo 10 menit ing kamar. suhu..Sawisé iku, sel wis dikumbah kaping pindho karo PBS, scraped lan resuspended ing es-kadhemen PBS buffer ngemot EDTA-free protease inhibitor (MCE, #HY-K0011).Sel wis lysed dening sonicating tip kanggo 1 menit (1 detik lan 1 detik mati ing 35% amplitudo).Campuran asil disentrifugasi ing 15,871 xg kanggo 10 menit ing 4 ° C kanggo mbusak lebu, lan konsentrasi supernatant disetel dadi 4 mg / mL nggunakake kit assay protein BCA (Beyotime, #P0009).Gabungke 1 ml lysate ndhuwur karo 0,1 mM photodegradable biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA ligan (Aladdin, #T162437), lan 1 mM CuSO4 inkubator rotasi munggah kanggo 1 jam ing suhu kamar.Sawise reaksi sworo seru, tambahake campuran kasebut menyang larutan sing wis dicampur (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) ing vial kaca 10 ml.Sampel dicampur lan disentrifugasi ing 4500 g suwene 10 menit ing suhu kamar.Solusi ngisor lan ndhuwur dibuwang, endapan dikumbah kaping pindho kanthi 1 ml metanol lan disentrifugasi ing 15871 × g suwene 5 menit ing 4 ° C.Tambah 1 ml 8 M urea (Aladdin, no. U111902) ing 25 mM amonium bikarbonat (ABC, Aladdin, no. A110539) kanggo dissolve precipitate.Sampel direkonstitusi kanthi 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 ing 25 mM ABC) suwene 40 menit ing 55 ° C banjur ditambahake iodoacetamide seger 15 mM (Sangon, #A600539) ing suhu kamar ing peteng.Alkilasi ing 30 menit..Tambahan 5 mM dithiothreitol ditambahake kanggo mungkasi reaksi kasebut.Siapke kira-kira 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) kanggo saben sampel kanthi ngumbah kaping 3 nganggo 1 ml PBS.Solusi proteome ing ndhuwur diencerke karo 5 ml PBS lan diinkubasi karo manik-manik agarose NeutrAvidin sing wis dicuci kanggo 4 jam ing suhu kamar.Manik-manik kasebut banjur dikumbah 3 kali nganggo 5 ml PBS sing ngandhut 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 kali nganggo 5 ml PBS sing ngandhut 1M urea, lan 3 kali nganggo 5 ml ddH2O.Manik-manik kasebut banjur dipanen kanthi sentrifugasi lan disuspensi maneh ing 200 μl 25 mM ABC sing ngemot 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) lan 20 ng / μl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize sewengi ing 37 ° C kanthi rotasi.Reaksi kasebut mandheg kanthi nambah asam format (Thermo, # A117-50) nganti pH tekan 2-3.Manik-manik kasebut dikumbah 3 kali kanthi 1 ml PBS sing ngandhut 0,2% SDS, 3 kali karo 1 ml PBS sing ngandhut 1 M urea, banjur 3 kali nganggo 1 ml banyu suling.Peptida sing diowahi dibebasake kanthi lisis cahya (365 nm) sajrone 90 menit kanthi nggunakake 200 μl 70% MeOH.Sawise centrifugation, supernatant diklumpukake.Manik-manik kasebut banjur dikumbah sepisan nganggo 100 μl MeOH 70% lan supernatan dikumpulake.Sampel dikeringake ing konsentrator vakum Speedvac lan disimpen ing -20 ° C nganti analisis.
Kanggo ngenali lan ngitung peptida sing diowahi oksigen singlet, conto dibubarake maneh ing asam format 0,1% lan 1 μg peptida dianalisis nggunakake spektrometer massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid sing dilengkapi sumber ESI nano saka Tune lan Xcalibur saka piranti lunak vendor 4.3.Sampel dipisahake ing kolom kapiler kanthi ukuran 75 µm × 15 cm kanthi bahan C18 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) lan disambungake menyang sistem EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Peptida kasebut dipisahake kanthi kromatografi gradien 95 menit linier saka 8% pelarut B dadi 50% pelarut B (A = 0,1% asam format ing banyu, B = 0,1% asam format ing 80% asetonitril), banjur tambah linear dadi 98% B min. ing 6 min ing tingkat aliran 300 nl / min.Orbitrap Fusion Lumos ngumpulake data kanthi gantian antarane scan MS lengkap lan scan MS2 gumantung saka data kasebut.Tegangan sputtering disetel dadi 2.1 kV lan suhu kapiler transportasi ion yaiku 320 ° C.Spektrum MS (350-2000 m/z) diklumpukake kanthi resolusi 120.000, AGC 4 × 105, lan wektu input maksimal 150 ms.10 prekursor multiply charged sing paling umum ing saben scan lengkap dipérang nggunakake HCD kanthi energi tabrakan normal 30%, jendela isolasi quadrupole 1,6 m/z, lan setelan resolusi 30.000.Target AGC kanggo spektrometri massa tandem nggunakake 5 × 104 lan wektu input maksimum 150 ms.Pangecualian dinamis disetel dadi 30 detik. Ion sing ora ditugasake utawa sing duwe muatan 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS. Ion sing ora ditugasake utawa sing duwe muatan 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS. Неназначенные ионы utawa ионы с зарядом 1+ lan >7+ были отклонены для МС/МС. Ion utawa ion sing ora ditugasake kanthi muatan 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。 Неуказанные ионы utawa ионы с зарядами 1+ lan >7+ utawa отклонены для МС/МС. Ion utawa ion sing ora ditemtokake kanthi biaya 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS.
Data mentah diproses nggunakake platform komputasi FragPipe adhedhasar MSFragger.Bias massa lan asam amino sing cocog ditemtokake nggunakake algoritma telusuran mbukak kanthi toleransi massa prekursor -150 nganti 500 Da.Peptida sing diowahi banjur diidentifikasi nggunakake modifikasi histidine kanthi hasil massa +229.0964 lan +247.1069 Da ing PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Sel-sel sing nyatakake gen miniSOG sing digabungake kanthi stabil dilapisi ing piring 6 cm.Sawise tekan ~ 80% confluence, sel dikumbah sapisan nganggo HBSS (Gibco, #14025092), banjur diinkubasi nganggo probe kimia ing HBSS sajrone 1 jam ing 37 ° C lan dipadhangi lampu biru.10W LED kanggo 20 menit ing suhu kamar.Kanggo nemtokake jinis spesies oksigen reaktif sing melu PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ditambahake ing sel minangka suplemen.Sawise ngumbah karo PBS kadhemen, sel padha scraped, diklumpukake ing 1,5 ml tabung centrifuge, lan sonicated karo tip kanggo 1 min ing 200 μl PBS karo 1x inhibitor protease tanpa EDTA (1 s lan 1 s tanpa, amplitudo 35%).Campuran sing diasilake disentrifugasi ing 15,871 × g suwene 10 menit ing 4 ° C lan konsentrasi supernatan disetel dadi 1 mg / mL nggunakake kit uji protein BCA.Kira-kira 50 µl saka lysate ndhuwur iki inkubasi karo 0,1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM TBTA ligan, lan 1 mM CuSO4 kanggo 1 jam ing suhu kamar kanthi rotasi saka ngisor menyang ndhuwur.Sawise reaksi klik, udan karo aseton ditindakake kanthi nambahake 250 μl aseton sing wis didinginake menyang sampel, diinkubasi ing -20 ° C kanggo 20 menit lan sentrifugasi ing 6010 × g kanggo 10 menit ing 4 ° C.Kumpulake pelet lan godhok ing 50 µl 1x buffer Laemmli kanggo 10 menit ing 95 °C.Sampel banjur dianalisis ing gel dawa SDS-PAGE lan digambarake nggunakake sistem pencitraan Bio-rad ChemiDoc MP Touch kanthi piranti lunak Image Lab Touch.
Ekspresi lan pemurnian protein miniSOG-6xHis rekombinan ditindakake kaya sing diterangake sadurunge.Sedhela, sel E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) diowahi kanthi pET21a-miniSOG-6xHis lan ekspresi protein diinduksi kanthi 0,5 mM IPTG (Sangon, # A600168).Sawise lisis sel, protein diresiki nggunakake manik-manik Ni-NTA agarose (MCE, no. 70666), dialisis marang PBS, lan disimpen ing -80 ° C.
Kanggo tes jarak label in vitro adhedhasar antibodi, campur 100 μM miniSOG sing dimurnèkaké, 1 mM probe 3, lan 1 μg anti-label mouse antibodi monoklonal (TransGen, #HT501-01) ing PBS nganti volume reaksi total 50 μl..Campuran reaksi disinari nganggo lampu LED biru kanggo 0, 2, 5, 10, lan 20 menit ing suhu kamar.Campuran kasebut diinkubasi karo 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, lan 1 mM CuSO4 kanggo 1 jam ing suhu kamar ing shaker gerakan munggah.Sawise reaksi cepet, tambahake 4x buffer Laemmli langsung menyang campuran lan godhok ing 95 ° C suwene 10 menit.Sampel dianalisis ing gel SDS-PAGE lan dianalisis kanthi blotting kulon karo streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, # SE068).
Peptida sintetik sing ngemot histidine kanthi amidasi terminal C (LHDALDAK-CONH2) digunakake kanggo nganalisa label in vitro adhedhasar peptida sing cedhak.Ing tes iki, 100 μM miniSOG diresiki, 10 mM probe 3 lan 2 μg / ml peptida sintetik dicampur ing PBS kanthi volume reaksi total 50 μl.Campuran reaksi disinari nganggo lampu LED biru suwene 1 jam ing suhu kamar.Siji mikroliter sampel dianalisis nggunakake sistem LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobilitas Time-of-Flight spektrometer massa kanthi piranti lunak analisis spektrum MassLynx).
Sel HEK293T kanthi stabil nyatakake gen fusi miniSOG ditanem ing piring 10 cm kanggo garis kanthi lokalisasi organel sing beda (Mito, ER, Nukleus) lan piring 15 cm kanggo garis Parkin-miniSOG lan BRD4-miniSOG.Sawise tekan ~ 90% confluence, sel kasebut dikumbah sapisan nganggo HBSS, banjur diinkubasi karo probe 3 ing HBSS sajrone 1 jam ing 37 ° C lan dipadhangi nganggo LED biru 10 W ing suhu kamar.Kanggo pelabelan non-kontak Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) kanthi probe 3 ing HBSS ditambahake sajrone 1 jam ing 37°C.Lisis sel, kimia klik, reduksi lan langkah-langkah alkilasi padha karo sing kasebut ing ndhuwur, kajaba 2 mg lisat ditambahake lan biotin PEG3 azide digunakake ing reaksi klik tinimbang biotin azida sing bisa didegradasi.Sawise pengayaan, manik-manik kasebut dikumbah 3 kali kanthi 5 ml PBS sing ngandhut 0,2% SDS, 3 kali karo 5 ml PBS sing ngemot 1 M urea, lan 3 kali nganggo 5 ml PBS.Salajengipun, 2 µg tripsin ditambahake ing 300 µl 25 mM ABC ngemot 1 M urea kanggo mecah protein ing wayah wengi ing 37 ° C.Reaksi kasebut mandheg kanthi nambah asam format nganti pH 2-3 tekan.Sawise trypsinization ing manik, solusi peptida desalted nggunakake kolom SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) lan garing ing konsentrator vakum Speedvac.Peptida dibubarake maneh ing 0,1% asam format lan 500 ng peptida dianalisis nggunakake spektrometer massa Orbitrap Fusion Lumos Tribrid sing dilengkapi sumber nano-ESI sing kasebut ing ndhuwur.Peptida dipisahake ing precolumns RP-HPLC komersial (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) lan kolom RP-HPLC analitik (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), loro diisi 2 μm.gradien saka 8% nganti 35% ACN ing 60 menit, banjur tambah linear dadi 98% B ing 6 menit kanthi laju aliran 300 Nl / min.Spektrum MS (350-1500 m/z) diklumpukake kanthi resolusi 60.000, AGC 4 × 105, lan wektu input maksimal 50 ms.Ion sing dipilih dipérang sacara berurutan dening HCD ing siklus 3 s kanthi energi tabrakan normal 30%, jendela isolasi quadrupole 1,6 m / z, lan resolusi 15000. A 5 × 104 tandem spektrometer massa target AGC lan wektu injeksi maksimum saka 22 ms digunakake.Pengecualian dinamis disetel dadi 45 detik. Ion sing ora ditugasake utawa sing duwe muatan 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS. Ion sing ora ditugasake utawa sing duwe muatan 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS. Неназначенные ионы utawa ионы с зарядом 1+ lan >7+ были отклонены для МС/МС. Ion utawa ion sing ora ditugasake kanthi muatan 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。 Неуказанные ионы utawa ионы с зарядами 1+ lan >7+ utawa отклонены для МС/МС. Ion utawa ion sing ora ditemtokake kanthi biaya 1+ lan> 7+ ditolak kanggo MS/MS.
Langkah-langkah persiapan sampel nganti pengayaan manik NeutrAvidin padha karo analisis LC-MS / MS sing kasebut ing ndhuwur.Kira-kira 50 μg lysate digunakake minangka input kanggo kontrol loading lan 2 mg lysate digunakake kanggo reaksi klik.Sawise pengayaan lan ngumbah nganggo neutravidin, protein sing kaiket diencerake kanthi nambahake 50 μl buffer Laemmli menyang manik resin agarose lan digodhog ing 95 ° C suwene 5 menit.Input beban kontrol lan sampel manik-manik dianalisis dening SDS-PAGE lan ditransfer menyang membran PVDF (Millipore, #ISEQ00010) kanthi metode blot Western standar.Membran kasebut diblokir nganggo susu skim 5% (Sangon, #A600669) ing TBS sing ngemot 0,1% tween-20 (TBST) lan diinkubasi kanthi urutan karo antibodi primer lan sekunder.Antibodi primer diencerake 1:1000 ing susu skim 5% ing TBST lan diinkubasi sewengi ing 4 ° C.Antibodi sekunder digunakake kanthi rasio 1: 5000 lan diinkubasi sajrone 1 jam ing suhu kamar.Membran kasebut digambarake kanthi chemiluminescence nggunakake sistem pencitraan Chemidoc MP.Kabeh scan uncut saka blots lan gel ing tokoh diwenehi minangka data mentah.
Antibodi utama sing digunakake ing panliten iki kalebu antibodi monoklonal anti-SFPQ terwelu (CST, no. 71992), antibodi monoklonal anti-FUS anti-FUS (CST, no. 67840), antibodi poliklonal anti-NSUN2 terwelu (Proteintech, no. 20854-1- AP), antibodi poliklonal anti-mSin3A kelinci (Abcam, #ab3479), antibodi monoklonal anti-tag tikus (TransGen, #HT201-02), antibodi monoklonal anti-β-actin tikus (TransGen, #HC201-01), anti kelinci -CDK2 antibodi monoklonal (ABclonal, #A0094), antibodi monoklonal terwelu kanggo CTBP1 (ABclonal, #A11600), antibodi poliklonal terwelu kanggo DUT (ABclonal, #A2901), antibodi poliklonal terwelu kanggo PSMC4 (ABclonal, #A2505), kelinci anti- Antibodi poliklonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Antibodi iki digunakake ing pengenceran 1:1000 ing susu skim 5% ing TBST.Antibodi sekunder sing digunakake ing panliten iki kalebu IgG anti-terwelu (TransGen, #HS101-01), IgG anti-mouse (TransGen, #HS201-01) ing pengenceran 1:5000.
Kanggo luwih neliti apa BRD4 sesambungan karo SFPQ, stabil HEK293T lan BRD4-miniSOG sel overexpressing HEK293T padha dilapisi ing 10 piring cm.Sel wis dikumbah nganggo PBS kadhemen lan dilisis ing 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) karo inhibitor protease bebas EDTA sajrone 30 menit ing 4 ° C.Sawisé iku, lysates diklumpukake ing 1,5 ml tabung centrifuge lan centrifuge ing 15,871 xg kanggo 10 menit ing 4 ° C.Supernatan dipanen lan diinkubasi nganggo 5 µg anti-V5 antibodi monoklonal tikus (CST, #80076) sewengi ing suhu 4°C.Cuci kira-kira 50 µl protein A/G manik-manik magnetik (MCE, #HY-K0202) kaping pindho nganggo PBS sing ngemot 0,5% Tween-20.Banjur lysates sel diinkubasi nganggo manik-manik magnetik sajrone 4 jam ing suhu 4 ° C kanthi rotasi saka ngisor menyang ndhuwur.Banjur manik dikumbah kaping papat kanthi 1 ml buffer PBST lan digodhog ing 95 ° C suwene 5 menit.Sampel dianalisis ing gel SDS-PAGE lan ditransfer menyang membran PVDF nggunakake metode Western blot standar.Membran kasebut diblokir ing susu skim 5% ing TBST lan diinkubasi kanthi urutan karo antibodi primer lan sekunder.Antibodi Primer Kelinci anti-SFPQ antibodi monoklonal (CST, #71992) digunakake kanthi rasio 1:1000 ing susu skim 5% ing TBST lan diinkubasi sewengi ing 4 ° C.IgG anti-terwelu digunakake kanthi rasio 1:5000 lan diinkubasi sajrone 1 jam ing suhu kamar.Membran kasebut digambarake kanthi chemiluminescence nggunakake sistem pencitraan Chemidoc MP.
Kabeh struktur sing digunakake kanggo analisis Solvent Accessible Surface Area (SASA) dijupuk saka Protein Data Bank (PDB)52 utawa AlphaFold Protein Structure Database53.SASA Absolute diwilang kanggo saben residu nggunakake program FreeSASA.Mung data SASA lengkap lan ora ambigu kanggo histidine label lan tanggane digunakake kanggo njupuk rata-rata SASA kanggo saben struktur.Aksesibilitas pelarut relatif (RSA) kanggo saben histidine diitung kanthi mbagi nilai SASA absolut kanthi area permukaan residu maksimum empiris sing kasedhiya kanggo pelarut.Kabeh histidine banjur diklasifikasikake minangka didhelikake yen RSA rata-rata kurang saka 20%, yen ora katon56.
File mentah sing dipikolehi ing mode DDA digoleki nggunakake Proteome Discoverer (v2.5) utawa MSfragger (Fragpipe v15.0) ing basis data protein sing diverifikasi SwissProt sing ngemot kontaminasi umum.Peptida mbutuhake tripsin lengkap kanthi rong situs pembelahan sing ilang, metilasi karbamoil minangka modifikasi tetep lan oksidasi metionin minangka modifikasi dinamis.Toleransi bobot prekursor lan fragmen disetel dadi 10 ppm lan 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Kena kontaminasi dibusak, lan protein disaring kanggo entuk tingkat panemuan palsu <1%. Kena kontaminasi dibusak, lan protein disaring kanggo entuk tingkat panemuan palsu <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного %. Kena kontaminasi dibusak lan protein disaring kanggo menehi tingkat deteksi palsu <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаруже%. Kena kontaminasi dibusak lan protein disaring kanggo entuk tingkat positif palsu <1%.Kanggo analisis kuantitatif tanpa nggunakake label, isi protein sing dinormalisasi saka telung pengulangan biologis digunakake.Analisis lokalisasi subselular protein ditindakake kanthi nggunakake analisis Gene Ontology (GO) saka DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 lan database sing disusun lan diterbitake dening grup Alice Ting.Peta gunung geni dijupuk saka Perseus (v1.6.15.0). Owah-owahan lipatan kelimpahan protein dites kanggo makna statistik nggunakake t-test loro-sisi, lan protein hits diidentifikasi kanthi owah-owahan kelimpahan> 2 (kajaba nyatakake) lan nilai p <0.05. Owah-owahan lipatan kelimpahan protein dites kanggo makna statistik nggunakake t-test loro-sisi, lan protein hits diidentifikasi kanthi owah-owahan kelimpahan> 2 (kajaba nyatakake) lan nilai p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Owah-owahan lipatan isi protein dites kanggo makna statistik nggunakake t-test loro-buntut, lan cocog protein diidentifikasi kanthi owah-owahan isi> 2 (kajaba dicathet) lan nilai ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 测试 测试 变化 变化 的 统计 显着性, 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度丰度> 2 (除非 另 有 说明) 和 p 值 <0.05.使用 双边 t 检验 检验 测试 测试 变化 的 统计 的 中 并 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Signifikansi statistik saka owah-owahan lipatan ing isi protein dites nggunakake t-test loro-buntut, lan cocog protein ditemtokake kanggo owah-owahan isi> 2 (kajaba dituduhake) lan p-nilai <0.05.Analisis interaksi protein ditindakake nggunakake analisis GO bebarengan karo database String.
Telung replika biologis ditindakake kanthi asil sing padha.Analisis statistik ditindakake kanthi GraphPad Prism (software GraphPad) lan plot gunung geni digawe karo Perseus (v1.6.15.0).Kanggo mbandhingake rong klompok kasebut, nilai-p ditemtokake kanthi nggunakake tes t Student two-tailed.Mung protein tunggal sing diidentifikasi paling ora kaping pindho ing klompok eksperimen sing kalebu ing plot gunung geni, lan nilai-nilai sing ilang ing grup kontrol diganti karo Perseus saka distribusi normal supaya nilai-p bisa diitung.Bar kesalahan nuduhake rata-rata ± standar deviasi.Ing analisis proteomik kanggo analisis statistik, kelimpahan protein sing muncul ing paling ora rong replika biologi ditahan.Cara statistik ora digunakake kanggo nemtokake ukuran sampel.Eksperimen kasebut ora acak.Peneliti ora wuta karo tugas sajrone eksperimen lan evaluasi asil.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain sinau, waca abstrak Laporan Riset Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.
Data spektrometri massa sing dipikolehi ing panliten iki diajukake menyang Konsorsium ProteomeXchange liwat repositori mitra iProX57 miturut dataset ID PXD034811 (dataset PDPL-MS).Data mentah diwenehake kanthi bentuk file data mentah.Artikel iki nyedhiyakake data asli.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ngerteni lingkungan: nggunakake biotinilasi gumantung jarak kanggo ciri kompleks protein lan organel peta. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Ngerteni lingkungan: nggunakake biotinilasi gumantung jarak kanggo ciri kompleks protein lan organel peta.Gingras, AS, Abe, KT lan Raut, B. Keahlian karo lingkungan: nggunakake biotinilasi sing gumantung jarak kanggo menehi ciri kompleks protein lan organel peta. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Pangerten lingkungan: nggunakake katergantungan lingkungan ing urip biologi.Gingras, AS, Abe, KT lan Raut, B. Pangertosan jarak: karakterisasi kompleks protein lan pemetaan organel nggunakake biotinilasi gumantung jarak.saiki.panemuku.Kimia.biologi 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.Pemetaan lingkungan mikro kanthi nransfer energi Dexter menyang sel imun.Ilmu 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Jaringan skala loro-proteome ndeteksi remodeling spesifik sel saka interaksi manungsa.Sel 184, 3022–3040.e3028 (2021).